本文關(guān)鍵詞：腫瘤酸性微環(huán)境對人乳腺癌腫瘤細(xì)胞干性及糖代謝作用及機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腫瘤干細(xì)胞是一群具有高抗放化療特性,能夠進(jìn)行自我更新,自我修復(fù),保持有一定的全能性,并且具有多向分化潛能,能夠在體外形成克隆的一群比例極小的細(xì)胞亞群,目前被認(rèn)為是造成腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源之一 腫瘤干細(xì)胞干性的維持需要其所處的微環(huán)境的支持。腫瘤微環(huán)境可以保證腫瘤干細(xì)胞處于靜息與未分化狀態(tài),維持腫瘤干細(xì)胞增殖與分化的潛能。酸性微環(huán)境是所有腫瘤組織的共性,大量的研究證實,惡性腫瘤組織周圍的pH值在6.9-6.0之間,甚至更低達(dá)到5.8。而正常組織周圍的pH值一般穩(wěn)定保持在7.35-7.45之間。長期以來人們認(rèn)為酸性微環(huán)境是低氧微環(huán)境所造成的,而忽略了腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的代謝表型——瓦伯格效應(yīng)(Warburg Effect),即腫瘤細(xì)胞無論是在有氧還是低氧環(huán)境下都進(jìn)行糖酵解反應(yīng),從而產(chǎn)生大量的乳酸,造成氫離子外排,進(jìn)而形成了酸性微環(huán)境。 Lin28是一類從低等生物到高等生物都高度保守的RNA結(jié)合蛋白。最近的研究發(fā)現(xiàn),Lin28能夠促進(jìn)細(xì)胞重編程從而維持干細(xì)胞的自我更新能力和多能性,然而Lin28調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分子機(jī)制并不十分清楚。Lin28作為RNA結(jié)合蛋白,可以參與抑制一些nicroRNAs的加工成熟,使得Lin28成為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵分子。 之前人們主要的研究方向都放在了低氧微環(huán)境對于腫瘤干細(xì)胞干性的維持上,鮮有文獻(xiàn)報道酸性微環(huán)境對于腫瘤干細(xì)胞干性的影響以及代謝與干性維持之間的關(guān)系。Lin28在調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞干性與代謝相互作用之間的分子機(jī)制也并不十分明確。 本研究為了明確有氧糖酵解代謝所產(chǎn)生的酸性微環(huán)境對于腫瘤干細(xì)胞的影響,分別在pH6.8和7.4的環(huán)境下,培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤干細(xì)胞ALDHhigh細(xì)胞亞群的變化情況；在DNA水平和蛋白質(zhì)水平,檢測干性基因SOX2、OCT4、Lin28b的表達(dá)情況；利用體外成球?qū)嶒?檢測成球能力的差別；利用劃痕實驗,檢測腫瘤細(xì)胞遷移能力的改變情況。同時通過PCR、WesternBlot檢測相關(guān)信號通路TCF4/β-catenin的激活情況,探究酸性微環(huán)境對于腫瘤干細(xì)胞影響的可能作用機(jī)制。 結(jié)果顯示,酸性微環(huán)境可以通過激活TCF4/β-catenin信號通路上調(diào)Lin28b表達(dá),提高M(jìn)DA-MB-231的ALDHhigh細(xì)胞亞群的比例,上調(diào)干性相關(guān)基因的表達(dá),增強(qiáng)體外成球能力和遷移能力。 為了明確干性與有氧糖酵解相互作用的關(guān)系,建立敲低干性關(guān)鍵分子Lin28b的MDA-MB-231穩(wěn)定細(xì)胞系,在DNA水平和蛋白質(zhì)水平,檢測有氧糖酵解相關(guān)基因(GLUT1, PKM2, LDHA,PDK1)的表達(dá)；利用Cell Titer-Blue Cell Viability Assay試劑盒,檢測細(xì)胞ATP生成量；通過PCR篩選與Lin28b相關(guān)microRNAs的表達(dá),探究Lin28b調(diào)節(jié)代謝的可能作用機(jī)制。 結(jié)果顯示,干性關(guān)鍵分子Lin28b可以通過下調(diào)miR-34a-5p,從而促進(jìn)有氧糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),下調(diào)細(xì)胞ATP的生成。 為了明確有氧糖酵解代謝所產(chǎn)生的酸性微環(huán)境對于腫瘤細(xì)胞代謝的影響。分別在pH6.8和7.4的環(huán)境下,培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。在DNA水平和蛋白質(zhì)水平,檢測有氧糖酵解相關(guān)基因(GLUT1,PKM2,LDHA,PDK1)和miR-34a-5p的表達(dá)；利用Cell Titer-Blue Cell Viability Assay試劑盒,檢測細(xì)胞ATP生成量。同時利用TCF4/β-catenin/Lin28b信號通路抑制劑,檢測信號通路阻斷后有氧糖酵解相關(guān)基因(GLUT1,PKM2,LDHA,PDK1)的表達(dá)情況。 結(jié)果顯示,酸性微環(huán)境可以通過激活TCF4/β-catenin信號通路上調(diào)Lin28b,從而下調(diào)miR-34a-5p,進(jìn)而顯著上調(diào)有氧糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),同時明顯下調(diào)細(xì)胞ATP的生成量。 通過以上實驗結(jié)果,我們主要得到了以下結(jié)論：酸性微環(huán)境可以激活TCF4/β-catenin信號通路,上調(diào)Lin28b的表達(dá),從而一方面提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞的干性,維持腫瘤干細(xì)胞表型；另一方面通過下調(diào)miR-34a-5p,從而促進(jìn)有氧糖酵解相關(guān)基因(GLUT1,PKM2,LDHA,PDK1)的表達(dá),下調(diào)細(xì)胞ATP的生成,促進(jìn)糖酵解反應(yīng),加速乳酸的生成和氫離子的外排,從而進(jìn)一步促進(jìn)酸性微環(huán)境的形成。本研究為深入認(rèn)識腫瘤酸性環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的干性以及代謝特征之間的相互關(guān)系進(jìn)行了有意義的探索。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 腫瘤干細(xì)胞 酸性微環(huán)境 有氧糖酵解 Lin28b
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 目錄3-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 中英文縮略表10-11
• 前言11-21
• 第一節(jié) 癌癥復(fù)發(fā)新力量：腫瘤干細(xì)胞及其微環(huán)境11-15
• 1. 腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定12-13
• 2. 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境13-14
• 3. RNA結(jié)合蛋白Lin28與腫瘤干細(xì)胞14-15
• 第二節(jié) 新的腫瘤研究思路：異常代謝的結(jié)果15-18
• 1. 腫瘤細(xì)胞的代謝特點15-17
• 2. 代謝型與干性維持的關(guān)系17-18
• 第三節(jié) 腫瘤治療的新視野18-19
• 1. 傳統(tǒng)的靶向癌基因策略18-19
• 2. 腫瘤治療的新靶向19
• 第四節(jié) 本課題的假設(shè)和研究目的及意義19-21
• 材料與方法21-36
• 第一節(jié) 實驗材料21-24
• 1. 儀器設(shè)備21-22
• 2. 菌株、細(xì)胞系和載體22
• 3. 實驗試劑22-24
• 第二節(jié) 溶液的配置24-27
• 1. 細(xì)胞培養(yǎng)基和有關(guān)溶液24-25
• 2. DEPC處理水(1L)25
• 3. 10×PBS(1L)25
• 4. 大腸桿菌培養(yǎng)基的配制25
• 5. SDS-PAGE溶液配制25-26
• 6. DNA電泳緩沖液配制(10×TBE)26
• 7. Western Blotting相關(guān)溶液26-27
• 第三節(jié) 實驗方法27-36
• 1. 細(xì)胞培養(yǎng)27-28
• 2. Western Blot28-30
• 3. RT-PCR和Real-time PCR30-32
• 4. 啟動子雙熒光報告質(zhì)粒的構(gòu)建32-34
• 5. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染34
• 6. 熒光素酶活性檢測34-35
• 7. 細(xì)胞劃痕實驗和體外成球?qū)嶒?/span>35
• 8. 流式細(xì)胞術(shù)35
• 9. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計35-36
• 實驗結(jié)果36-57
• 第一節(jié) 腫瘤酸性微環(huán)境對人乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的影響36-42
• 1. 腫瘤酸性微環(huán)境增加人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 ALDH~(high)細(xì)胞群比例36-37
• 2. 腫瘤酸性微環(huán)境上調(diào)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231干性基因的表達(dá)37-39
• 3. 腫瘤酸性微環(huán)境提高人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231體外成球能力39-40
• 4. 腫瘤酸性微環(huán)境增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的遷移能力40-42
• 第二節(jié) 腫瘤酸性微環(huán)境通過TCF4/β-catenin/Lin28b通路調(diào)節(jié)人乳腺癌腫瘤細(xì)胞干性42-47
• 1. Lin28b可以調(diào)節(jié)干性基因的表達(dá)42-43
• 2. 敲低Lin28b可以阻斷酸性微環(huán)境誘導(dǎo)的干性基因的表達(dá)上調(diào)43-44
• 3. 腫瘤酸性微環(huán)境激活TCF4/β-catenin信號通路44-45
• 4. TCF4/β-catenin復(fù)合體可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)Lin28b45-47
• 第三節(jié) 干性對于人乳腺癌腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解的影響47-53
• 1. 腫瘤干細(xì)胞亞群ALDH~(high)有氧糖酵解相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)47
• 2. 敲低Lin28b的表達(dá)可以下調(diào)人乳腺癌細(xì)胞有氧糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)47-48
• 3. 敲低Lin28b的表達(dá)可以增強(qiáng)人乳腺癌腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)ATP的生成48-49
• 4. 敲低Lin28b的表達(dá)可以上調(diào)miR-34a-5p的表達(dá)49-50
• 5. 過表達(dá)miR-34a-5p可以下調(diào)有氧糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)50-51
• 6. 抑制miR-34a-5p的表達(dá)可以上調(diào)有氧糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)51-53
• 第四節(jié) 腫瘤酸性微環(huán)境對人乳腺癌腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解代謝的影響53-57
• 1. 腫瘤酸性微環(huán)境可以通過下調(diào)miR-34a-5p上調(diào)有氧糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)53
• 2. 腫瘤酸性微環(huán)境可以上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α的表達(dá)53-55
• 3. 腫瘤酸性微環(huán)境下人乳腺癌腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)ATP的生成量降低55
• 4. 抑制TCF4/β-catenin/Lin28b信號通路可以顯著下調(diào)有氧糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)55-57
• 討論57-61
• 總結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 個人簡歷68-69
• 致謝69-70

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：267983