【摘要】：Hippo信號通路是首先在果蠅中通過遺傳學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、器官大小以及干細(xì)胞自我更新的重要信號通路。該通路在進(jìn)化上非常保守,哺乳動物中,Hippo信號通路的核心是一條激酶鏈,MST1/2激酶和其適配蛋白SAV共同磷酸化激活LATS1/2,活化的LATS1/2激酶和其適配蛋白MOB進(jìn)一步磷酸化并抑制下游底物YAP。YAP作為Hippo信號通路的下游效應(yīng)分子,是一個轉(zhuǎn)錄輔激活因子,它主要通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TEAD促進(jìn)下游基因的表達(dá)。這些基因在細(xì)胞增殖、凋亡以及干細(xì)胞更新中發(fā)揮重要作用,并介導(dǎo)Hippo信號通路的生物學(xué)功能。胞外信號可以調(diào)控LATS1/2的磷酸化水平,進(jìn)而調(diào)控其激酶活性。同時泛素化修飾也是LATS2的重要調(diào)控機(jī)制,例如細(xì)胞缺氧時,LATS2被E3泛素連接酶SIAH2泛素化修飾,進(jìn)而被蛋白酶體降解。然而,目前為止我們?nèi)圆磺宄{(diào)控LATS2蛋白去泛素化過程的具體機(jī)制。為了研究LATS2新的調(diào)控機(jī)制,我們從LATS2的相互作用蛋白入手,將LATS2進(jìn)行蛋白串聯(lián)親和純化。對其產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn) E3 泛素連接酶 anaphase-promoting complex/cyclosome(APC/C)復(fù)合物以及去泛素化酶USP9X是LATS2的相互作用蛋白。研究中我們觀察到,細(xì)胞內(nèi)的APC1和LATS2在類似膜泡結(jié)構(gòu)上有共定位,但是這兩個蛋白的亞細(xì)胞定位互不影響。進(jìn)一步的研究證明APC/C復(fù)合物不調(diào)控LATS2的蛋白水平以及激酶活性。另一方面,細(xì)胞內(nèi)敲減USP9X之后,LATS2的蛋白水平明顯降低。我們進(jìn)一步構(gòu)建USP9X的敲除細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在敲除USP9X的細(xì)胞中LATS2的蛋白穩(wěn)定性顯著下降。之后通過細(xì)胞內(nèi)泛素化水平檢測實(shí)驗以及體外去泛素化實(shí)驗,我們證明去泛素化酶USP9X可以去泛素化LATS2進(jìn)而保護(hù)其不被蛋白酶體降解。已有研究表明USP9X在胰腺癌中是一個抑癌基因,例如在KrasG12D誘導(dǎo)胰腺癌的小鼠模型中進(jìn)行基因篩選,發(fā)現(xiàn)USP9X在多于50%的腫瘤樣本中都有突變。但USP9X如何發(fā)揮抑癌功能尚不清楚。因而,我們在胰腺癌細(xì)胞中敲減USP9X,發(fā)現(xiàn)YAP磷酸化下降,活性上升。最后,軟瓊脂克隆實(shí)驗以及裸鼠成瘤實(shí)驗證實(shí)USP9X在胰腺癌中通過抑制LATS2以及激活YAP發(fā)揮抑癌作用。綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)USP9X是Hippo信號通路中關(guān)鍵激酶LATS2的去泛素化酶。并且在胰腺癌中,USP9X通過Hippo信號通路發(fā)揮抑癌的生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)了泛素化修飾調(diào)控Hippo通路的重要機(jī)制,并闡明了 USP9X在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用的效應(yīng)機(jī)制,為疾病治療以及藥物研發(fā)提供了新的研究方向。
【圖文】：

３．１ＡＰＣ／Ｃ亞ＵＳＰ９ＸＬＡＴＳ２互３．１．１串聯(lián)親和純化發(fā)現(xiàn)ＬＡＴＳ２的相互作用蛋白逡逑為了進(jìn)一步闡明激酶ＬＡＴＳ２的調(diào)控機(jī)理和生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)逡逑Ｆｌａｇ－ＳＢＰ－ＬＡＴＳ２的ＭＣＦ１０Ａ細(xì)胞。并對ＬＡＴＳ２蛋白進(jìn)行串聯(lián)親和純化，產(chǎn)物進(jìn)逡逑行質(zhì)譜分析。由此，我們希望通過發(fā)現(xiàn)ＬＡＴＳ２的相互作用蛋白來進(jìn)一步探究其調(diào)逡逑控機(jī)制和功能。由于ＬＡＴＳ２會抑制細(xì)胞生長，構(gòu)建ＬＡＴＳ２的穩(wěn)定細(xì)胞會非常困逡逑難，所以我們構(gòu)建了邋ＬＡＴＳ２－ＫＲ這一失活型突變體的穩(wěn)定細(xì)胞用于研究。此次純逡逑化得到很多能與ＬＡＴＳ２相互作用的蛋白（圖３－１Ａ），其中Ｍ０Ｂ１Ａ和ＮＦ２是ＬＡＴＳ２逡逑已知的結(jié)合蛋白（圖３－１Ｂ）。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中各蛋白的相互作用肽鏈數(shù)目的高低進(jìn)逡逑行排序，在高結(jié)合能力的蛋白中包括很多與泛素化相關(guān)的蛋白，，例如去泛素化酶逡逑ＵＳＰ９Ｘ以及Ｅ３泛素連接酶ＡＰＣ／Ｃ復(fù)合物中的很多亞基（ＡＮＡＰＣ１、ＡＮＡＰＣ５、逡逑ＣＤＣ１６、ＣＤＣ２３和ＣＤＣ２６）（圖３－１Ｂ）。同時，我們通過免疫印跡的方法證實(shí)ＬＡＴＳ２逡逑的邋ＴＡＰ邋樣品中邋ＡＰＣ１邋（ＡＮＡＰＣ１）、ＡＰＣ５邋（ＡＮＡＰＣ５）以及邋ＵＳＰ９Ｘ邋確實(shí)和邋ＬＡＴＳ２逡逑存在相互作用（圖３－１Ｃ）。逡逑

細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒，ＵＳＰ９Ｘ－ＣＡ是ＵＳＰ９Ｘ的Ｃ１５６６Ａ失活突變體。細(xì)胞裂解逡逑液使用抗ＨＡ的抗體進(jìn)行免疫沉淀，樣品通過免疫印跡的方法檢測。Ｂ，內(nèi)源ＵＳＰ９Ｘ逡逑和ＬＡＴＳ２存在相互作用。ＭＣＦ１０Ａ細(xì)胞中內(nèi)源的ＵＳＰ９Ｘ和ＬＡＴＳ２分別用抗ＵＳＰ９Ｘ逡逑和ＬＡＴＳ２的抗體進(jìn)行免疫沉淀。Ｃ，邋ＬＡＴＳ２結(jié)合ＵＳＰ９Ｘ的能力比ＡＭＯＴ強(qiáng)。逡逑ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒，細(xì)胞裂解液使用抗Ｈａｇ的抗體進(jìn)行免疫沉淀。逡逑Ｄ，邋ＬＡＴＳ２和ＡＭＯＴＬ２結(jié)合ＵＳＰ９Ｘ的能力互不影響。實(shí)驗方法參照圖Ｃ。逡逑３．２ＡＰＣ１和ＵＳＰ９Ｘ分別與ＬＡＴＳ２的不同區(qū)域存在相互作用逡逑３．２．１邋ＡＰＣ１的１６４９－１７４８片段和ＬＡＴＳ２的Ｎ端１－９０區(qū)域存在相互作用逡逑為了明確ＡＰＣ１和ＬＡＴＳ２的具體結(jié)合區(qū)域，我們構(gòu)建一系列ＡＰＣ１以及ＬＡＴＳ２逡逑的截短體和突變體。由于在構(gòu)建ＡＰＣ１野生型質(zhì)粒時意外得到并發(fā)現(xiàn)ＡＰＣ１的１－逡逑３７逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R73-3

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本文編號：2670306