【摘要】：目的:探討過表達(dá)Twist1是否促進(jìn)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞多藥耐藥性(MDR)的獲得,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法:利用過表達(dá)Twist1的慢病毒載體Twist1-GFP-LV及陰性對(duì)照病毒NC-GFP-LV轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞,分別稱為實(shí)驗(yàn)組(SW620/Twist1)和對(duì)照組(SW620-NC),對(duì)兩組細(xì)胞作以下檢測(cè):(1)確定過表達(dá)效果:(1)RT-qPCR檢測(cè)Twist1 m RNA相對(duì)表達(dá)量;(2)Western blot檢測(cè)Twist1蛋白表達(dá);(2)細(xì)胞對(duì)化療藥物奧沙利鉑及5-FU的耐藥性通過CCK8法檢測(cè):首先檢測(cè)兩種藥物對(duì)SW620細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),用該濃度的藥物分別作用于兩組細(xì)胞,在加藥后24h、48h及72h,檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率的差異;(3)耐藥指標(biāo)檢測(cè):(1)ABCB1、ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)通過RT-qPCR檢測(cè),(2)ABCB1(P-gp)、ABCG2(BCRP)蛋白表達(dá)通過Western blot檢測(cè);(4)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè):CD133、CD44表達(dá)通過流式直標(biāo)抗體技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果:(1)過表達(dá)效果測(cè)定:(1)RT-q PCR檢測(cè)Twist1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果為:實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組中Twist1 m RNA相對(duì)表達(dá)值為(2.54±0.31)及(0.97±0.33),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組增高約2.6倍(P0.01),(2)Western blot檢測(cè)Twist1蛋白表達(dá)值在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中分別為(1.12±0.03)及(0.53±0.02),實(shí)驗(yàn)組顯著增高(P0.01),提示Twist1過表達(dá)效果滿意,細(xì)胞建模成功。(2)奧沙利鉑與5-FU對(duì)SW620細(xì)胞的IC50分別為14.33ug/ml和41.62ug/ml,分別采用IC50濃度的奧沙利鉑和5-FU作用于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,檢測(cè)兩組細(xì)胞三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)時(shí)的增殖抑制率。結(jié)果提示與對(duì)照組對(duì)比,實(shí)驗(yàn)組中兩種化療藥物在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增殖抑制率均下降,但24h時(shí)差異不明顯(P0.05)、48h、72h時(shí)抑制率均顯著降低(48h,P0.05;72h,P0.01)。以上結(jié)果表明過表達(dá)Twist1后細(xì)胞對(duì)兩種化療藥物均產(chǎn)生耐藥,呈現(xiàn)出MDR特性;(3)耐藥基因及蛋白檢測(cè):(1)RT-qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中ABCB1(P-gp)mRNA、ABCG2(BRCP)mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(2.0.2±0.12)及(0.94±0.23)、(2.45±0.38)及(0.91±0.22),與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組中兩種基因mRNA相對(duì)表達(dá)均增高(P0.01);(2)Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中ABCB1(P-gp)蛋白表達(dá)量為(0.70±0.03)及(0.35±0.05),ABCG2(BCRP)蛋白表達(dá)量為(0.75±0.12)及(0.29±0.08),對(duì)比對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組中兩種蛋白表達(dá)明顯提高(P0.01)。(4)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè):流式直標(biāo)抗體檢測(cè)兩組細(xì)胞CD133的陽性率分別為(54.3±2.6)%及(78.6±3.8)%;CD44的陽性率分別為(5.6±1.2)%及(12.5±2.0)%,過表達(dá)Twist1后,腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133及CD44表達(dá)均顯著增高(P0.01)。結(jié)論:過表達(dá)Twist1可促進(jìn)直腸癌SW620細(xì)胞耐藥指標(biāo)ABCB1(P-gp)、ABCG2(BRCP)表達(dá),使腫瘤細(xì)胞獲得MDR,該現(xiàn)象可能與Twist1高表達(dá)提高SW620細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、促進(jìn)干性獲得有關(guān)。
【圖文】：

- 22 -轉(zhuǎn)染過表達(dá)病毒組，明視野（100×） 轉(zhuǎn)染過表達(dá)病毒組，熒光視野（100×）圖1 SW620轉(zhuǎn)染圖片F(xiàn)ig1. The image of formal transfection in SW6202.2 RT-qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組Twist1 mRNA相對(duì)表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參，采用RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中Twist1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示SW620/Twist1與SW620-NC兩組Twist1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為（2.54±0.31）及（0.97±0.33）。與對(duì)照組對(duì)比，，實(shí)驗(yàn)組Twist1 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著增高（P＜0.01）（見圖2）。

檢測(cè)兩組細(xì)胞Twist1 mRNA表達(dá)水平；與SW620-NC組比較，vels of Twist1 detected by RT-qPCR. Compared with SW620-NC, lot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組Twist1蛋白表達(dá)為內(nèi)參，western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Twist1蛋白表3）及（0.53±0.02）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Twist1蛋見圖3）。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 付紅燁;陰彬;彭小忠;;小鼠皮質(zhì)神經(jīng)祖細(xì)胞分化過程中Twist1的功能[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年06期

2 ;Effect and mechanism of the Twist gene on invasion and metastasis of gastric carcinoma cells[J];World Journal of Gastroenterology;2008年16期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 黎江;Oct4B1在結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的表達(dá)及其與Twist的相關(guān)性研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

本文編號(hào)：2667234