【摘要】：第一部分前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系及組織中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜目的:(1)通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法獲取前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系及組織中環(huán)狀RNA(circRNAs)的表達(dá)譜。(2)篩選出前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系及組織中差異表達(dá)的circRNAs。(3)對(duì)差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行功能預(yù)測(cè)及分析。方法:選擇3種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系(正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1、前列腺癌原發(fā)灶細(xì)胞系22RV1、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3)及65對(duì)前列腺癌與癌旁組織,進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并結(jié)合生物信息學(xué)方法綜合分析。結(jié)果:(1)3種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中共識(shí)別出9,545個(gè)circRNAs,其中845個(gè)circRNAs在3種細(xì)胞系中均有表達(dá),同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)的circRNAs。GO功能分析和KEGG通路分析提示這些差異表達(dá)circRNAs的宿主基因具有重要的生物學(xué)功能并在許多重要的分子信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。(2)采用DCC、find_circ和circRNA_finder這三種算法在65對(duì)前列腺癌與癌旁組織中共識(shí)別出277,122個(gè)circRNAs,其中三種算法共同識(shí)別出的circRNAs有82,797個(gè)。非監(jiān)督聚類和PCA分析提示前列腺癌與癌旁組織中circRNAs的表達(dá)譜存在明顯差異,其中有9個(gè)circRNAs在前列腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào),86個(gè)circRNAs在前列腺癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。對(duì)這95個(gè)差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行功能預(yù)測(cè)提示其與相應(yīng)的miRNAs具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論:(1)circRNAs在前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系及組織中均廣泛存在,而且不同細(xì)胞系及組織之間具有顯著表達(dá)差異;(2)生物信息學(xué)分析顯示,前列腺癌中差異表達(dá)的circRNAs可能通過競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNAs發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功能,或與其宿主基因一起參與前列腺癌的疾病進(jìn)展,并可能具有潛在的診斷應(yīng)用價(jià)值。第二部分前列腺癌中差異表達(dá)環(huán)狀RNA的驗(yàn)證及作用研究目的:(1)對(duì)前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系及組織中circRNAs的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。(2)結(jié)合細(xì)胞系測(cè)序及驗(yàn)證結(jié)果分析環(huán)狀RNA-circFUT8在前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中的表達(dá)差異及意義;(3)結(jié)合組織測(cè)序及驗(yàn)證結(jié)果探討環(huán)狀RNA-circAMACR在前列腺癌診斷及進(jìn)展過程中的作用及意義。方法:(1)選擇測(cè)序結(jié)果中部分差異表達(dá)的circRNAs,采用qRT-PCR的方法分別在正常前列腺上皮細(xì)胞系與前列腺癌細(xì)胞系、前列腺癌與癌旁組織中對(duì)其進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證。(2)結(jié)合細(xì)胞系測(cè)序結(jié)果選擇circFUT8(在正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1中低豐度表達(dá),在前列腺癌原發(fā)灶細(xì)胞系22RV1和前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3中表達(dá)逐漸升高)為研究對(duì)象,對(duì)其在前列腺癌細(xì)胞系與正常前列腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)差異進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,并結(jié)合其宿主基因功能,分析circFUT8在前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及雄激素非依賴轉(zhuǎn)化過程中的作用及意義。(3)結(jié)合組織測(cè)序結(jié)果選擇circAMACR(在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)最為顯著,fold change=6.19,P=1×10~(-13))為研究對(duì)象,對(duì)其在前列腺癌組織與癌旁組織、前列腺癌細(xì)胞系與正常前列腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)差異進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,并通過siRNA干擾前列腺癌細(xì)胞中circAMACR的表達(dá),觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,探討其在前列腺癌診斷及進(jìn)展過程中的作用及意義。結(jié)果:(1)前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系及組織中差異表達(dá)circRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致。(2)circFUT8在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于正常前列腺上皮細(xì)胞系,在前列腺癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(PC-3、DU145)中的表達(dá)顯著高于前列腺癌原發(fā)灶細(xì)胞系(22RV1),在雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系(PC-3、DU145)中的表達(dá)也顯著高于雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系(LNCap)。(3)circAMACR在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織,在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)也顯著高于正常前列腺上皮細(xì)胞系。circAMACR主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,干擾前列腺癌細(xì)胞中circAMACR的表達(dá)后,細(xì)胞的增殖和遷移能力減弱。結(jié)論:(1)通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲取的前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系及組織中的circRNAs表達(dá)譜是可靠的。(2)circFUT8在前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中具有獨(dú)特的差異表達(dá)模式,可能參與了前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及雄激素非依賴轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程。(3)circAMACR在前列腺癌中具有腫瘤特異性并且在其進(jìn)展過程中具有一定的腫瘤生物學(xué)作用。第三部分環(huán)狀RNA應(yīng)用于前列腺癌血漿檢測(cè)的初步研究目的:(1)提高前列腺癌患者血漿中circRNAs檢測(cè)的穩(wěn)定性;(2)篩選前列腺癌與良性前列腺增生患者血漿中qRT-PCR檢測(cè)的最適內(nèi)參基因數(shù)目及最適內(nèi)參基因組合。(3)初步探討circRNAs應(yīng)用于前列腺癌血漿檢測(cè)的臨床意義。方法:(1)改進(jìn)血漿樣本總RNA提取方法,優(yōu)化前列腺癌患者血漿中circRNAs檢測(cè)的qRT-PCR反應(yīng)條件。(2)利用前列腺癌和良性前列腺增生各10例患者的血漿樣本,對(duì)β-Actin、GAPDH、18s rRNA、β_2M、GUSB、HPRT1、PPIA、SDHA等8個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),并使用NormFinder和geNorm軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。(3)利用45例前列腺癌和30例良性前列腺增生患者的血漿樣本,對(duì)組織測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)顯著的29個(gè)circRNAs(表達(dá)上調(diào)9個(gè),表達(dá)下調(diào)20個(gè))進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),并結(jié)合組織測(cè)序及驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果:(1)本研究實(shí)驗(yàn)體系下前列腺癌與良性前列腺增生患者血漿中qRT-PCR檢測(cè)的最適內(nèi)參基因數(shù)目為2個(gè),最適內(nèi)參基因組合為GAPDH和PPIA。(2)血漿qRT-PCR檢測(cè)時(shí),有9個(gè)circRNAs無擴(kuò)增曲線,14個(gè)circRNAs的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)無目的條帶,3個(gè)circRNAs的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)雜帶明顯,只有3個(gè)circRNAs(circAPLF、circLPAR1和circSLC45A4)在前列腺癌與良性前列腺增生患者血漿中穩(wěn)定表達(dá)。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血漿中的總體表達(dá)水平顯著低于良性前列腺增生患者,而circLPAR1在前列腺癌與良性前列腺增生患者血漿中的總體表達(dá)水平無顯著差異。結(jié)論:(1)在前列腺癌患者血漿中進(jìn)行circRNAs檢測(cè)是可行的,但應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)體系做出適當(dāng)優(yōu)化。(2)GAPDH和PPIA的內(nèi)參基因組合可作為均一化標(biāo)準(zhǔn)用于前列腺癌與良性前列腺增生患者血漿樣本的qRT-PCR檢測(cè)。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血漿中穩(wěn)定存在,且總體表達(dá)水平顯著低于良性前列腺增生患者,提示其對(duì)于前列腺癌具有一定的診斷應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

S2 275 7.56 41.7 20 151.2S3 278 4.73 25.8 20 94.6S4 273 5.05 28.0 20 101.0S5 274 7.01 38.8 20 140.2S6 277 7.05 38.5 20 141.0S7 275 5.61 30.9 20 112.2S8 274 7.70 42.6 20 154.0S9 275 7.76 42.7 20 155.2簇產(chǎn)生前，調(diào)整文庫到 10 nM。前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中 circRNAs 的總體表達(dá)譜本次細(xì)胞系測(cè)序結(jié)果顯示，在 RWPE-1 細(xì)胞系中共識(shí)別出 5,341 個(gè) circRNAsV1 細(xì)胞系中共識(shí)別出 3,247 個(gè) circRNAs，在 PC-3 細(xì)胞系中共識(shí)別出 4,30cRNAs，其中絕大部分 circRNAs 來源于蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子環(huán)化，cRNAs 的具體來源分類情況見圖 1-2 及表 1-3。

C-3 2261 440 364 205 48 226 33 728 進(jìn)一步比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，有 845 個(gè) circRNAs 在 3 種細(xì)胞系中均有表達(dá)，有circRNAs 同時(shí)在 RWPE-1 細(xì)胞系和 22RV1 細(xì)胞系中有表達(dá)，有 245 個(gè) circR在 22RV1 細(xì)胞系和 PC-3 細(xì)胞系中有表達(dá)，有 902 個(gè) circRNAs 同時(shí)在 RW系和 PC-3 細(xì)胞系中有表達(dá)。故本次細(xì)胞系測(cè)序共識(shí)別出 9,545 個(gè) circRNAs前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中 circRNAs 的差異表達(dá)譜利用標(biāo)準(zhǔn)化的 reads 數(shù)，計(jì)算兩個(gè)或兩組樣品間的差異表達(dá) circRNAs。計(jì)算（fold change）和 P 值，以倍數(shù)變化≥2.0，P 值＜0.05 作為差異表達(dá) circR值。通過比對(duì) 3 種細(xì)胞系中 circRNAs 的表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)，在 22RV1 細(xì)胞PE-1 細(xì)胞系之間共識(shí)別出 443 個(gè)差異表達(dá) circRNAs，在 PC-3 細(xì)胞系與 22RV之間共識(shí)別出 409 個(gè)差異表達(dá) circRNAs，在 PC-3 細(xì)胞系與 RWPE-1 細(xì)胞系別出 362 個(gè)差異表達(dá) circRNAs（圖 1-3）。3 種細(xì)胞系之間差異表達(dá)（上調(diào)、下5 的 circRNAs 見表 1-4。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長嶺;;中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2013年04期

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本文編號(hào)：2664262