【摘要】：研究目的:肝細(xì)胞性肝癌是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌,全世界每年新增超過70萬個新病例,是近十年來最普遍發(fā)生的癌癥之一,其致死率在各類癌癥中位居第一。肝細(xì)胞性肝癌由于其復(fù)雜的病理學(xué)機(jī)制,大大加重了臨床上對其進(jìn)行診斷與治療的難度,同時其預(yù)后情況也不甚理想,超過2年生存期的預(yù)后病例不足5%。對于該病的提早診斷、有效治療及改善預(yù)后狀況有十分重要的意義。近年來,盡管有很多分子生物學(xué)研究已經(jīng)致力于探究肝細(xì)胞性肝癌的潛在的病理學(xué)機(jī)制,但我們對其詳細(xì)分子機(jī)制仍然認(rèn)識的不夠全面。本研究旨在通過對與肝細(xì)胞性肝癌相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析,進(jìn)而運用系統(tǒng)生物學(xué)工具確定肝細(xì)胞性肝癌相關(guān)的生物靶標(biāo)分子,探索肝細(xì)胞性肝癌內(nèi)在的生物過程及各個生物過程之間的聯(lián)系,以及基于網(wǎng)絡(luò)分析的方法來挖掘特異性疾病網(wǎng)絡(luò)中的疾病子網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)功能,可以為后續(xù)研究與臨床治療提供重要的支持。研究方法:1.文獻(xiàn)(研究)檢索與入選標(biāo)準(zhǔn)本研究通過在Gene Expression Omnibus(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫選定檢索特定芯片平臺(GPL570)關(guān)鍵字,并對其檢索結(jié)果進(jìn)行篩選,只保留肝細(xì)胞癌組織數(shù)據(jù)樣本以及肝細(xì)胞癌患者外周血單個個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell)樣本基因芯片數(shù)據(jù)集作為入選數(shù)據(jù)集。2.差異表達(dá)基因的篩選通過R軟件以及Affy軟件包對各個樣本表達(dá)數(shù)據(jù)集原始數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取預(yù)處理(去背景噪聲,標(biāo)準(zhǔn)化等)。此外,引入limma包來篩選各個數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因并根據(jù)閾值log(Fold Change)(log FC)1或log(Fold Change)(log FC)-1并且校正P值P.adjust0.05統(tǒng)一篩選得到每個表達(dá)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因(Different express gene,DEG)。通過將各個數(shù)據(jù)集所獲得的DEG進(jìn)行卡方檢驗并篩選meta值小于0.01的差異基因得到綜合基因集。通過對此基因集使用Genecards(http://www.genecards.org/)以及Phenolyzer(http://phenolyzer.wglab.org/)數(shù)據(jù)庫中疾病相關(guān)基因進(jìn)行篩選得到最終的綜合差異表達(dá)基因集。3.HCC相關(guān)差異表達(dá)基因的功能分析應(yīng)用Over-representation analysis(ORA)方法分別確定最終的綜合差異表達(dá)基因集中上調(diào)基因與下調(diào)基因中的顯著富集的KEGG生物學(xué)通路,并使用R軟件以及Cluster Profiler包對上述基因集進(jìn)行GO功能分析。4.功能互作分析根據(jù)顯著富集的KEGG生物學(xué)通路所映射的基因以及基因之間的交疊對通路之間的互相作用進(jìn)行打分并排序,將互作結(jié)果使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。觀察通路之間的相互作用關(guān)系。5.人類蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與疾病模塊構(gòu)建根據(jù)已搭建的人類蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction Network,PPIN)中所包含的228096個蛋白質(zhì)互作對以及16022個蛋白質(zhì),對得到的綜合差異表達(dá)基因集進(jìn)行映射,構(gòu)建肝細(xì)胞癌疾病特異性網(wǎng)絡(luò)。將疾病特異性蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化,并利用MCODE插件進(jìn)行疾病模塊的識別。6.網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)分析對已構(gòu)建的肝細(xì)胞癌疾病特異性網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點度進(jìn)行統(tǒng)計,并與參考基因集所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)(包含595個來自于cancer gene census database http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/的癌癥相關(guān)基因所映射的癌癥網(wǎng)絡(luò)以及242個帕金森癥相關(guān)基因鎖映射的帕金森癥疾病網(wǎng)絡(luò))的節(jié)點度進(jìn)行比較。估計構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)。研究結(jié)果:1.文獻(xiàn)(研究)檢索與入選標(biāo)準(zhǔn)通過以芯片平臺(GPL570(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)[GEO Accession])以及肝細(xì)胞癌組織[Title]或肝細(xì)胞癌癥外周單核細(xì)胞(PBMC)[Title]為關(guān)鍵字檢索GEO數(shù)據(jù)庫,共得到10個符合要求的表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集(截止至2017年5月),共包含488個樣本。2.差異表達(dá)基因的篩選經(jīng)過limma包以及閾值log(Fold Change)(log FC)1或log(Fold Change)(log FC)-1且滿足校正P值P.adjust0.05的統(tǒng)一篩選后,計算各個篩選后基因的meta P值,通過篩選meta P0.01的差異表達(dá)基因,共得到794個上調(diào)(Up-regulated)與959個下調(diào)(Down-regulated)基因。經(jīng)過與肝細(xì)胞癌性狀相關(guān)的3485個來自于Gene Cards的基因以及17720個來自于Phenolyzer的基因?qū)ζ溥M(jìn)行優(yōu)選后,共得到了444個DEG作為最終優(yōu)選基因集。3.生物學(xué)功能分析通過引入ORA(Overrepresentation analysis)方法對最終優(yōu)選基因集進(jìn)行KEGG功能分析,在117個上調(diào)基因中,7個通路(FDR0.05)顯著富集,267個下調(diào)基因中,27個通路被顯著富集。這些通路主要與P53信號通路,化學(xué)致癌因素,脂肪酸代謝和精氨酸合成等相關(guān)。此外,經(jīng)過R軟件包cluster Profiler進(jìn)行的GO功能分析結(jié)果顯示,此444個最終優(yōu)選基因集中,上調(diào)基因集主要與生物過程(Biological Processes,BP)中的細(xì)胞周期,有絲分裂核分裂,染色單體分離相關(guān)。另一方面,下調(diào)基因主要與BP中的對物質(zhì)或刺激的反應(yīng)(如無機(jī)物、藥物、金屬離子和胞外刺激)和有機(jī)酸分解代謝過程相關(guān)。4.功能互作分析我們引入了功能互作分析(Pathway crosstalk)來更進(jìn)一步地理解富集通路結(jié)果并發(fā)現(xiàn)它們之間的相互影響,最終從39個通路之中得到了171通路互相作用對�；谶@些結(jié)果,進(jìn)一步引入了cytoscape插件MCODE來尋找整體互作網(wǎng)絡(luò)之中的子部分模塊,最終得到了兩個互作模塊,其中一個模塊與多種癌癥通路和病毒感染相關(guān),另一個模塊主要包含化學(xué)致癌因素通路、發(fā)育相關(guān)生物通路以及能量代謝生物通路。5.人類蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與疾病模塊構(gòu)建通過將最終優(yōu)選基因集映射入已發(fā)表的人類蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)中,我們得到了肝細(xì)胞癌特異性疾病網(wǎng)絡(luò),其中共包含272個節(jié)點以及528條邊。將此網(wǎng)絡(luò)引入cytoscape進(jìn)行可視化并使用MCODE插件進(jìn)行模塊識別,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)5個模塊的MCODE分?jǐn)?shù)大于3。對此5個模塊進(jìn)行KEGG通路富集,結(jié)果顯示分?jǐn)?shù)最高的疾病模塊主要與類固醇激素生物合成、化學(xué)致癌、亞油酸代謝與色氨酸代謝相關(guān),其他四個模塊主要與細(xì)胞周期,P53信號通路,補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)。6.網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)分析經(jīng)過對肝細(xì)胞癌疾病特異性網(wǎng)絡(luò)、參考癌癥基因集特異性網(wǎng)絡(luò)以及帕金森基因集特異性網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點度進(jìn)行統(tǒng)計比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在節(jié)點度(degree)閾值高于200時,HCC特異網(wǎng)絡(luò)與癌癥相關(guān)特異網(wǎng)絡(luò)具有更相近的拓?fù)潢P(guān)系(其中HCC網(wǎng)絡(luò)平均節(jié)點度為42.3,癌癥相關(guān)特異網(wǎng)絡(luò)平均節(jié)點度為73.7,帕金森癥特異網(wǎng)絡(luò)平均節(jié)點度為32.9)。7.生存分析我們統(tǒng)計了在HCC特異性網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度排名前10與中介度排名前10的差異基因。通過對其進(jìn)行取交集,共得到了6個中心基因,分別為CDK1,MYC,CDKN1A,JUN,PCNA以及SHC1。其中CDK1擁有最高的節(jié)點得分(15.44)。為了評估這些中心基因,我們使用survival R包并引入了Kaplan-Meier圖對其進(jìn)行了生存分析。結(jié)果顯示兩個中心基因(JUN與CDK1)的表達(dá)量與生存時間成顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)論:1.肝細(xì)胞癌的潛在生物學(xué)分子機(jī)制十分復(fù)雜。經(jīng)過本研究的數(shù)據(jù)挖掘,主要與病毒感染,化學(xué)致癌因素、發(fā)育相關(guān)生物通路、P53信號通路以及能量代謝生物通路的異常相關(guān),引起肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。2.中心基因CDK1,MYC,CDKN1A,JUN,PCNA以及SHC1在肝細(xì)胞性細(xì)胞癌的發(fā)生與進(jìn)展中可能起到了關(guān)鍵作用,尤其是CDK1與SHC1的高表達(dá)與生存時間呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系�？勺鳛楦渭�(xì)胞性細(xì)胞癌后續(xù)進(jìn)一步研究的潛在生物靶點。3.與帕金森相關(guān)基因集相比,HCC相關(guān)基因以及癌癥特異相關(guān)基因具有更高的連通度,反映了癌癥與精神類疾病之間具有顯著差異。4.本文所使用的方法以及分析流程可也可以作為對于其他復(fù)雜疾病的研究思路框架,為探索更多的潛在的復(fù)雜疾病生物靶點提供一定的支持。
【圖文】：

圖 3.1.2 各候選基因集中 DEG 在各篩選環(huán)節(jié)的分布（A）上調(diào)差異表達(dá)基因在各實驗組中的分布；（B）下調(diào)差異表達(dá)基因在各實驗組中的分布。黑色柱狀圖代表各實驗組經(jīng)過初篩選得到的各自的差異表達(dá)基因數(shù)量；灰色柱狀圖代表經(jīng)過 meta 分析之后的綜合差異表達(dá)基因的數(shù)量；白色柱狀圖代表經(jīng)過優(yōu)選之后的差異表達(dá)基因的數(shù)量。橫軸代表對應(yīng)實驗編號，縱軸代表基因數(shù)量。3.2 功能富集分析3.2.1 KEGG 功能分析篩選顯著的HCC相關(guān)生物通路能夠幫助我們了解HCC潛在的生物分子機(jī)制進(jìn)一步的研究提供有指導(dǎo)意義的信息。通過引入過代表性分析（ORA）來發(fā)現(xiàn)隱含在最終差異表達(dá)基因集中的高顯著性生物通路，我們得到了許多有意義的富集結(jié)果。在上調(diào)差異基因的富集結(jié)果中，177 個基因的富集結(jié)果共包含 7 條顯著的 KEGG 通路（閾值為 FDR < 0.05），包含排名第一的通路細(xì)胞周期（cellcycle），DNA 復(fù)制（DNA replication），與癌癥相關(guān)的 P53 信號通路（p53 signaling

圖 3.2.1 pDEG 基因集 KEGG 生物通路富集結(jié)果。橫坐標(biāo)為通路名稱，縱坐標(biāo)為通路中與pDEG 基因集匹配的基因數(shù)量，顏色由紅至白代表顯著性由高至低3.2.2 Gene Ontology 功能分析此外，我們進(jìn)一步引入了 GO 功能分析，通過 R 軟件平臺的 clusterProfile 軟件包以及"enrichGO"函數(shù)，我們對上調(diào)差異基因以及下調(diào)差異基因分別進(jìn)行了GO 富集結(jié)果的繪制。對于 177 個上調(diào)基因，對生物過程的 GO 富集結(jié)果顯示細(xì)胞周期相關(guān)：如有絲分裂細(xì)胞周期相變（mitotic cell cycle phase transition）、有絲分裂細(xì)胞周期的調(diào)控（regulation of mitotic cell cycle）、有絲分裂細(xì)胞周期的 G1期轉(zhuǎn)換（G1/S transition of mitotic cell cycle）和有絲分裂核分裂（mitotic nucleardivision）；此外還有與染色單體分離相關(guān)的項目，如：有絲分裂染色單體分離（mitotic chromatid segregation）、姊妹染色單體分離（sister chromatid segregation）等。另一方面，對于 267 個下調(diào)基因，，GO BP 結(jié)果顯示其主要與外界物質(zhì)刺激相
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

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本文編號：2656284