【摘要】：背景甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)是最常見的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然甲狀腺癌在任何年齡都可發(fā)生,但是發(fā)病人群以中青年女性居多。甲狀腺癌雖然占總的惡性腫瘤的比例較低,但是近些年來(lái)其發(fā)病率逐漸上升。從一些研究報(bào)告中可以得出,甲狀腺癌在美國(guó)女性常見的惡性腫瘤的排名已經(jīng)上升至第五位。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展,甲狀腺癌已經(jīng)逐漸上升為惡性腫瘤疾病中的第七位,社會(huì)各界對(duì)甲狀腺癌的關(guān)注逐漸提高。因此,積極進(jìn)行預(yù)防和治療甲狀腺癌具有重要意義和科學(xué)價(jià)值。生物活性肽因其理化性質(zhì)及其較高的生物活性又被稱為功能肽。含有10個(gè)以上但不超過(guò)50個(gè)氨基酸殘基的被總稱為多肽。研究發(fā)現(xiàn)生物活性肽對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)非常重要,生物活性肽的應(yīng)用非常廣泛,目前主要用于保健品以及調(diào)整免疫功能等方面。目前通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)已經(jīng)鑒定出許多抗腫瘤的多肽,其中包括兩條肽,即CYYGQSKYC(P6)和LSPPRYP(P9)。P6肽可以通過(guò)阻斷血管生長(zhǎng)因子C與其受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3結(jié)合,從而能夠抑制腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲。P9肽能夠阻斷堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子與纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合,從而抑制黑色素瘤生長(zhǎng)。本課題將P6肽與P9肽通過(guò)柔性連接子Gly-Gly-Gly(GGG)連接起來(lái),形成一條新型多肽CYYGQSKYCGGGLSPPRYP,即P11肽。本課題采用生物活性肽P11進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn):細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡以及信號(hào)通路檢測(cè)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立裸鼠移植瘤模型、檢測(cè)血管新生等來(lái)研究生物活性肽P11對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制。目的研究生物活性P11肽對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用及其分子機(jī)制。方法1、體外實(shí)驗(yàn)1.1 MTS實(shí)驗(yàn)進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn),對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞系TT、ARO和TPC-1細(xì)胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h后,在酶標(biāo)儀上準(zhǔn)確測(cè)量各組的OD值,檢測(cè)各組甲狀腺癌細(xì)胞的活力。1.2 EDU實(shí)驗(yàn)進(jìn)行EDU實(shí)驗(yàn),對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞系TT、ARO和TPC-1細(xì)胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h后,通過(guò)與Apollo567熒光染料發(fā)生特異性反應(yīng),在倒置熒光顯微鏡下避光拍攝腫瘤細(xì)胞,用來(lái)檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞增殖率=(EdU陽(yáng)性細(xì)胞)/(總細(xì)胞數(shù))×100%。1.3細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞劃痕、遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn),對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞TT、ARO和TPC-1細(xì)胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h,分別在0 h、12 h以及24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照,通過(guò)分析細(xì)胞劃痕的愈合情況以及穿透的細(xì)胞數(shù)來(lái)檢測(cè)各組人甲狀腺癌細(xì)胞的遷移以及侵襲能力。1.4 Western Blot檢測(cè)對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞TT、ARO和TPC-1細(xì)胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h,提取甲狀腺癌細(xì)胞蛋白,檢測(cè)各組甲狀腺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、8、9和Cleaved PARP以及PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR和p-mTOR的表達(dá)水平,以β-actin為參照。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)2.1建立裸鼠移植瘤模型建立腫瘤模型:將人甲狀腺癌細(xì)胞TT、ARO和TPC-1細(xì)胞按照5×10~6個(gè)細(xì)胞量在每只裸鼠右側(cè)腋下進(jìn)行無(wú)菌注射,24 h后觀察成瘤情況,接種腫瘤成功率達(dá)100%。2.2腫瘤抑制率測(cè)定實(shí)驗(yàn)分組以及給藥情況:接種后24 h,分別將接種人甲狀腺癌TT、ARO和TPC-1細(xì)胞的裸鼠按體重隨機(jī)分5組,每組6只:陰性對(duì)照組(生理鹽水)、P6肽組(320μg/kg/d)、P9肽組(320μg/kg/d)、P6肽+P9肽組(320μg/kg/d)、P11肽組(320μg/kg/d)。各組均采用瘤旁注射,按照0.1 mL/10 g的給藥體積進(jìn)行,連續(xù)進(jìn)行4周,實(shí)驗(yàn)期間裸鼠自由飲食和飲水。每日測(cè)量裸鼠移植瘤的長(zhǎng)(a)短(b),按照公式:V(volume)=ab~2/2計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,裸鼠處死后,取出腫瘤并稱重,按照公式:IR(inhibitory rate)=[(A-B)/A]×100%,A為對(duì)照組裸鼠體重,B為給藥組裸鼠體重。2.3 HE染色腫瘤組織取出后,經(jīng)10%甲醛固定,做常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片。切片厚度5μm,HE染色,顯微鏡下觀察病理組織學(xué)改變并拍照。2.4免疫組織化學(xué)染色將石蠟包埋腫瘤組織用CD31和Ki67抗體染色,然后孵育二抗,顯微鏡下觀察腫瘤組織中CD31與Ki67的表達(dá)水平。結(jié)果1、MTS和EDU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11顯著降低了人甲狀腺癌細(xì)胞TT、ARO和TPC-1增殖和存活率(P0.05)。2、細(xì)胞劃痕、遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯抑制人甲狀腺癌細(xì)胞TT、ARO和TPC-1遷移以及侵襲的能力(P0.05)。3、采用Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯提高人甲狀腺癌細(xì)胞TT、ARO和TPC-1中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表達(dá)水平(P0.05)。4、采用Western Blot檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯降低人甲狀腺癌細(xì)胞TT、ARO和TPC-1中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平(P0.05)。5、裸鼠移植瘤結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯抑制人甲狀腺癌TT、ARO和TPC-1移植瘤生長(zhǎng)(P0.05)。6、免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯降低裸鼠移植瘤組織中CD31和Ki67的表達(dá)水平(P0.05)。結(jié)論1、生物活性肽P11能夠抑制人甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力。2、生物活性肽P11通過(guò)阻斷PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路從而促進(jìn)人甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡。3、生物活性肽P11通過(guò)抑制腫瘤血管新生從而抑制人甲狀腺癌生長(zhǎng)。
【圖文】：

圖 3.1 P11 肽對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞活性以及增殖能力的作用對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞 TT、TPC-1 和 ARO 經(jīng)過(guò) 200 μmol/L 不同多肽藥物（P6、P9、P6+P9 和 P11肽）孵育 24 h 后，采用 MTS 和 EDU 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組多肽對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響。(A) MTS 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析（n=3）；(B) EDU 染色圖片（圖片放大倍數(shù)為 100×）；(C) 對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（n=6）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，*P < 0.05，**P < 0.01 vs 對(duì)照組；△P < 0.05，△△P <0.01 vs P6 肽；▲P < 0.05，▲▲P < 0.01 vs P9 肽，#P < 0.05，##P < 0.01 vs P6+P9 肽。3.2 生物活性肽 P11 抑制人甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell被用來(lái)檢測(cè)多肽對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。與正常組（control）相比，人甲狀腺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò) P6 肽、P9 肽、P6+P9 肽和 P11 肽孵育24 h 后，能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞的遷移（P < 0.05），與 P6 肽、P9 肽、P6+P9 肽相比，P11 肽明顯抑制了人甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲（P < 0.05）。生物活性肽 P11 對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞 TT、TPC-1 和 ARO 遷移與侵襲作用見圖 3.2。

圖 3.2 P11 肽對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞遷移與侵襲的作用對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞 TT、TPC-1 和 ARO 經(jīng)過(guò) 200 μmol/L 不同多肽藥物（P6、P9、P6+P9 和 P11肽）孵育 24 h 后，采用劃痕實(shí)驗(yàn)（A-B）、遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn)（C-F）檢測(cè)生物活性肽對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞遷移以及侵襲的影響（圖片放大倍數(shù)為 100×）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示（n=6）；*P < 0.05，**P < 0.01 vs 對(duì)照組；△P < 0.05，，△△P < 0.01 vs P6 肽；▲P < 0.05，▲▲P < 0.01 vsP9 肽，#P < 0.05，##P < 0.01 vs P6+P9 肽。3.3 生物活性肽 P11 促進(jìn)人甲狀腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞凋亡是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的一種重要途徑，在凋亡的過(guò)程中，cleaved caspase-3、8、9、cleaved PARP是評(píng)定腫瘤細(xì)胞凋亡的重要因素。上述相關(guān)指標(biāo)升高可以激活線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。從結(jié)果可以看出，在人甲狀腺癌細(xì)胞TT、TPC-1和ARO細(xì)胞中，與正常組相比，P9、P6+P9、P11肽組cleaved caspase-3、cleaved
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R736.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 石生林;劉彥群;潘敏慧;魯成;;柞蠶核型多角體病毒p11基因克隆及序列分析[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2009年02期

2 伊成龍;張樂(lè)福;徐雪蓮;;P11鋼在濕蒸汽中流動(dòng)加速腐蝕性能的模擬與實(shí)驗(yàn)研究[J];原子能科學(xué)技術(shù);2013年02期

3 周軍衛(wèi),李曉文,黃希順;良性家族性嬰兒驚厥疾病基因與染色體6p21.2-p11的連鎖分析[J];江蘇醫(yī)藥;2005年05期

4 黃方一;鐘毅;劉巖;;產(chǎn)植酸酶菌株青霉P11發(fā)酵條件的研究[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年06期

5 張莉莉;郭繼強(qiáng);張文;劉威;張志永;欒好江;王輝;;干擾素-α阻斷地塞米松對(duì)神經(jīng)細(xì)胞p11表達(dá)的上調(diào)作用[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2013年12期

6 孫合亮;王星明;居玲莎;楊嬌嬌;張廣芬;楊建軍;;海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子p11信號(hào)通路參與氯胺酮抗抑郁作用[J];臨床麻醉學(xué)雜志;2015年02期

7 王曙光,韓本立,段恒春;外源性層粘素P11片段對(duì)膽管癌細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年09期

8 姜海棠;岳瑩瑩;袁勇貴;;p11蛋白與抑郁癥[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2015年06期

9 楊秦政;王海東;李曉延;王挺;張偉棟;;P11耐熱鋼窄間隙焊接接頭組織分布特征與性能分析[J];原子能科學(xué)技術(shù);2016年06期

10 邵君逵;;解決1511M型織機(jī)墻板套筒P11松動(dòng)的方法[J];棉紡織技術(shù);1980年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 郭繼強(qiáng);馮來(lái)鵬;關(guān)丫丫;丁華夏;楊婷婷;王輝;;溶酶體和泛素-蛋白酶體途徑參與干擾素-α下調(diào)p11和5-羥色胺受體1b/[A];第十一屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2016年

2 侯妍妍;王少陽(yáng);冉金樂(lè);龍亮坤;;P11邊板外板后尾燈部位沖壓工藝探討[A];第十二屆河南省汽車工程科技學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

3 段光杰;楊海捷;劉友生;朱江;許成燕;;噬菌體展示肽庫(kù)篩選內(nèi)毒素結(jié)合肽P11的體外活性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

4 孫合亮;張廣芬;楊建軍;;p11在抑郁癥中的作用及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)會(huì)[CSIA]年會(huì)暨第二屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)術(shù)研討會(huì)、江蘇省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)麻醉專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2015年

5 馮來(lái)鵬;郭繼強(qiáng);王輝;;p11在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用[A];第十二屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2017年

6 孫合亮;張廣芬;王菁;周志強(qiáng);楊建軍;;p11在氯胺酮抗抑郁中的作用及相關(guān)機(jī)制[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)會(huì)[CSIA]年會(huì)暨第二屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)術(shù)研討會(huì)、江蘇省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)麻醉專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2015年

7 關(guān)丫丫;;S100A10(又稱為P11)在鼠傷寒感染小鼠過(guò)程中的作用及機(jī)制[A];第十一屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2016年

8 郭繼強(qiáng);程遠(yuǎn)芳;丁華夏;王輝;;p11對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SH-sy5y自噬的影響[A];第十屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)匯編[C];2015年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李曉莉;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子裂解通路和突觸可塑性在大鼠抑郁發(fā)病和抗抑郁治療中的作用研究[D];東南大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 田文柯;生物活性肽P11對(duì)人甲狀腺癌的抑制作用及其分子機(jī)制[D];河南大學(xué);2018年

2 楊婷婷;p11對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響及其作用機(jī)制[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2016年

3 姚廣印;P11及其與水蛭素C肽融合基因的高效表達(dá)和功能的研究[D];河北大學(xué);2007年

4 丁華夏;α-干擾素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中p11、5-HTR1b和5-HTR4表達(dá)的影響[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2016年

5 李艷濤;卒中后抑郁患者外周血單個(gè)核細(xì)胞p11基因表達(dá)的變化[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

6 陳亮;T7噬菌體衣殼蛋白P11的表達(dá)純化及單克隆抗體的制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

7 程遠(yuǎn)芳;p11對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

8 王偉;采用IFN-α治療的乙肝患者PBMC p11mRNA與抑郁癥的關(guān)系[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2016年

本文編號(hào)：2653293