【摘要】：背景甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)是最常見的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然甲狀腺癌在任何年齡都可發(fā)生,但是發(fā)病人群以中青年女性居多。甲狀腺癌雖然占總的惡性腫瘤的比例較低,但是近些年來其發(fā)病率逐漸上升。從一些研究報告中可以得出,甲狀腺癌在美國女性常見的惡性腫瘤的排名已經(jīng)上升至第五位。隨著我國經(jīng)濟社會的發(fā)展,甲狀腺癌已經(jīng)逐漸上升為惡性腫瘤疾病中的第七位,社會各界對甲狀腺癌的關(guān)注逐漸提高。因此,積極進行預(yù)防和治療甲狀腺癌具有重要意義和科學(xué)價值。生物活性肽因其理化性質(zhì)及其較高的生物活性又被稱為功能肽。含有10個以上但不超過50個氨基酸殘基的被總稱為多肽。研究發(fā)現(xiàn)生物活性肽對機體的生命活動非常重要,生物活性肽的應(yīng)用非常廣泛,目前主要用于保健品以及調(diào)整免疫功能等方面。目前通過噬菌體展示文庫技術(shù)已經(jīng)鑒定出許多抗腫瘤的多肽,其中包括兩條肽,即CYYGQSKYC(P6)和LSPPRYP(P9)。P6肽可以通過阻斷血管生長因子C與其受體血管內(nèi)皮生長因子受體3結(jié)合,從而能夠抑制腫瘤細胞遷移與侵襲。P9肽能夠阻斷堿性纖維母細胞生長因子與纖維母細胞生長因子受體結(jié)合,從而抑制黑色素瘤生長。本課題將P6肽與P9肽通過柔性連接子Gly-Gly-Gly(GGG)連接起來,形成一條新型多肽CYYGQSKYCGGGLSPPRYP,即P11肽。本課題采用生物活性肽P11進行體外實驗:細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡以及信號通路檢測和體內(nèi)實驗:建立裸鼠移植瘤模型、檢測血管新生等來研究生物活性肽P11對人甲狀腺癌細胞生長的作用機制。目的研究生物活性P11肽對人甲狀腺癌細胞生長作用及其分子機制。方法1、體外實驗1.1 MTS實驗進行MTS實驗,對人甲狀腺癌細胞系TT、ARO和TPC-1細胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h后,在酶標(biāo)儀上準(zhǔn)確測量各組的OD值,檢測各組甲狀腺癌細胞的活力。1.2 EDU實驗進行EDU實驗,對人甲狀腺癌細胞系TT、ARO和TPC-1細胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h后,通過與Apollo567熒光染料發(fā)生特異性反應(yīng),在倒置熒光顯微鏡下避光拍攝腫瘤細胞,用來檢測各組腫瘤細胞增殖情況。細胞增殖率=(EdU陽性細胞)/(總細胞數(shù))×100%。1.3細胞遷移及侵襲實驗進行細胞劃痕、遷移以及侵襲實驗,對人甲狀腺癌細胞TT、ARO和TPC-1細胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h,分別在0 h、12 h以及24 h對細胞進行拍照,通過分析細胞劃痕的愈合情況以及穿透的細胞數(shù)來檢測各組人甲狀腺癌細胞的遷移以及侵襲能力。1.4 Western Blot檢測對人甲狀腺癌細胞TT、ARO和TPC-1細胞給予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS為Control組)處理24 h,提取甲狀腺癌細胞蛋白,檢測各組甲狀腺癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、8、9和Cleaved PARP以及PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR和p-mTOR的表達水平,以β-actin為參照。2、體內(nèi)實驗2.1建立裸鼠移植瘤模型建立腫瘤模型:將人甲狀腺癌細胞TT、ARO和TPC-1細胞按照5×10~6個細胞量在每只裸鼠右側(cè)腋下進行無菌注射,24 h后觀察成瘤情況,接種腫瘤成功率達100%。2.2腫瘤抑制率測定實驗分組以及給藥情況:接種后24 h,分別將接種人甲狀腺癌TT、ARO和TPC-1細胞的裸鼠按體重隨機分5組,每組6只:陰性對照組(生理鹽水)、P6肽組(320μg/kg/d)、P9肽組(320μg/kg/d)、P6肽+P9肽組(320μg/kg/d)、P11肽組(320μg/kg/d)。各組均采用瘤旁注射,按照0.1 mL/10 g的給藥體積進行,連續(xù)進行4周,實驗期間裸鼠自由飲食和飲水。每日測量裸鼠移植瘤的長(a)短(b),按照公式:V(volume)=ab~2/2計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線,裸鼠處死后,取出腫瘤并稱重,按照公式:IR(inhibitory rate)=[(A-B)/A]×100%,A為對照組裸鼠體重,B為給藥組裸鼠體重。2.3 HE染色腫瘤組織取出后,經(jīng)10%甲醛固定,做常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片。切片厚度5μm,HE染色,顯微鏡下觀察病理組織學(xué)改變并拍照。2.4免疫組織化學(xué)染色將石蠟包埋腫瘤組織用CD31和Ki67抗體染色,然后孵育二抗,顯微鏡下觀察腫瘤組織中CD31與Ki67的表達水平。結(jié)果1、MTS和EDU實驗結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11顯著降低了人甲狀腺癌細胞TT、ARO和TPC-1增殖和存活率(P0.05)。2、細胞劃痕、遷移以及侵襲實驗結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯抑制人甲狀腺癌細胞TT、ARO和TPC-1遷移以及侵襲的能力(P0.05)。3、采用Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯提高人甲狀腺癌細胞TT、ARO和TPC-1中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表達水平(P0.05)。4、采用Western Blot檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯降低人甲狀腺癌細胞TT、ARO和TPC-1中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達水平(P0.05)。5、裸鼠移植瘤結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯抑制人甲狀腺癌TT、ARO和TPC-1移植瘤生長(P0.05)。6、免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:與正常組、P6肽組、P9肽組、P6+P9肽組相比,生物活性肽P11明顯降低裸鼠移植瘤組織中CD31和Ki67的表達水平(P0.05)。結(jié)論1、生物活性肽P11能夠抑制人甲狀腺癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力。2、生物活性肽P11通過阻斷PI3K-AKT-mTOR信號通路從而促進人甲狀腺癌細胞的凋亡。3、生物活性肽P11通過抑制腫瘤血管新生從而抑制人甲狀腺癌生長。
【圖文】：

圖 3.1 P11 肽對甲狀腺癌細胞活性以及增殖能力的作用對人甲狀腺癌細胞 TT、TPC-1 和 ARO 經(jīng)過 200 μmol/L 不同多肽藥物（P6、P9、P6+P9 和 P11肽）孵育 24 h 后，采用 MTS 和 EDU 實驗檢測各組多肽對人甲狀腺癌細胞增殖的影響。(A) MTS 結(jié)果統(tǒng)計分析（n=3）；(B) EDU 染色圖片（圖片放大倍數(shù)為 100×）；(C) 對細胞增殖能力進行統(tǒng)計（n=6）。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，*P < 0.05，**P < 0.01 vs 對照組；△P < 0.05，△△P <0.01 vs P6 肽；▲P < 0.05，▲▲P < 0.01 vs P9 肽，#P < 0.05，##P < 0.01 vs P6+P9 肽。3.2 生物活性肽 P11 抑制人甲狀腺癌細胞遷移和侵襲劃痕實驗以及Transwell被用來檢測多肽對人甲狀腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響。與正常組（control）相比，人甲狀腺癌細胞經(jīng)過 P6 肽、P9 肽、P6+P9 肽和 P11 肽孵育24 h 后，能夠抑制甲狀腺癌細胞的遷移（P < 0.05），與 P6 肽、P9 肽、P6+P9 肽相比，P11 肽明顯抑制了人甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲（P < 0.05）。生物活性肽 P11 對人甲狀腺癌細胞 TT、TPC-1 和 ARO 遷移與侵襲作用見圖 3.2。

圖 3.2 P11 肽對人甲狀腺癌細胞遷移與侵襲的作用對人甲狀腺癌細胞 TT、TPC-1 和 ARO 經(jīng)過 200 μmol/L 不同多肽藥物（P6、P9、P6+P9 和 P11肽）孵育 24 h 后，采用劃痕實驗（A-B）、遷移以及侵襲實驗（C-F）檢測生物活性肽對人甲狀腺癌細胞遷移以及侵襲的影響（圖片放大倍數(shù)為 100×）。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示（n=6）；*P < 0.05，**P < 0.01 vs 對照組；△P < 0.05，，△△P < 0.01 vs P6 肽；▲P < 0.05，▲▲P < 0.01 vsP9 肽，#P < 0.05，##P < 0.01 vs P6+P9 肽。3.3 生物活性肽 P11 促進人甲狀腺癌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達細胞凋亡是誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的一種重要途徑，在凋亡的過程中，cleaved caspase-3、8、9、cleaved PARP是評定腫瘤細胞凋亡的重要因素。上述相關(guān)指標(biāo)升高可以激活線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。從結(jié)果可以看出，在人甲狀腺癌細胞TT、TPC-1和ARO細胞中，與正常組相比，P9、P6+P9、P11肽組cleaved caspase-3、cleaved
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R736.1

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本文編號：2653293