【摘要】：研究目的:乳腺癌是全世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。近年來在中國,乳腺癌的發(fā)病率以每年3%的增長速度增加[2,3]。截止到2014年,中國新發(fā)乳腺癌患者占全球新發(fā)乳腺癌患者的12.2%,乳腺癌病死數(shù)達到了全球總數(shù)的9.6%[3,4]�；瘜W療法,簡稱化療,作為極為重要的乳腺癌臨床治療方式,能夠顯著延長乳腺癌患者的無病生存期及總生存期,提高患者術(shù)后生活質(zhì)量,在臨床中應用極為廣泛,造福了廣大乳腺癌患者。然而,由于乳腺癌細胞對化療藥物(如阿霉素)產(chǎn)生耐藥性常常導致化療失敗,威脅乳腺癌患者的生存。因此,研發(fā)出能夠抑制化療耐藥的輔助性治療藥物成為解決目前這一窘境的重要方式。為減少多重耐藥的產(chǎn)生,基礎(chǔ)研究以及臨床工作中通常采用不同藥物配伍使用的方式。近年來,聯(lián)合應用中藥治療乳腺癌越來越受到矚目[5]。許多研究表明,化療聯(lián)合中藥可降低化療引起的副反應,從而改善乳腺癌患者預后并提高生活質(zhì)量�；倍鳛閭鹘y(tǒng)中藥已有1,600年之久,近幾十年來,因其有效的抗癌作用已被常規(guī)用作乳腺癌的輔助治療藥物。但其對乳腺癌化療耐藥的作用尚不明確。本研究通過分子生物學基礎(chǔ)研究,探討槐耳對乳腺癌阿霉素耐藥的影響及其作用機制,為乳腺癌患者臨床用藥提供重要的理論依據(jù)。研究方法及結(jié)果:在本課題中,我們對槐耳抑制乳腺癌阿霉素耐藥的機制進行了全面深入的研究,具體研究內(nèi)容主要包括以下四部分:第一部分乳腺癌阿霉素耐藥細胞株的建立及槐耳抑制阿霉素耐藥研究方法:經(jīng)過長達8個月時間的研究及培育,我們團隊在體外應用阿霉素(0.01uM~0.1mM)逐步加壓誘導篩選MDA-MB-231細胞,最終培養(yǎng)出耐阿霉素的耐藥細胞株(231/Dox)。乳腺癌阿霉素耐藥細胞的耐藥表型利用含50ng/ml阿霉素的DMEM培養(yǎng)基加壓培養(yǎng)加以維持。通過MTT實驗分別檢測乳腺癌阿霉素耐藥細胞系(231/Dox)及親代MDA-MB-231乳腺癌細胞系對阿霉素的敏感性,以驗證阿霉素耐藥細胞系是否成功建立及槐耳對乳腺癌阿霉素耐藥乳腺癌細胞耐藥性的影響。研究結(jié)果:MTT實驗結(jié)果顯示,乳腺癌阿霉素耐藥乳腺癌細胞相較于親代MDA-MB-231乳腺癌細胞,其對阿霉素殺傷作用的敏感性降低,表現(xiàn)為耐藥細胞的IC50數(shù)值的增加,是非耐藥細胞IC50值的3.27倍。MTT實驗檢測結(jié)果提示槐耳可抑制乳腺癌阿霉素耐藥細胞系231/Dox的生長,并可顯著增加阿霉素耐藥細胞系對阿霉素的敏感性。第二部分槐耳可促進乳腺癌阿霉素耐藥細胞的凋亡研究方法:為深入研究槐耳抑制阿霉素耐藥乳腺癌細胞耐藥性的分子生物學機制,我們利用流式細胞學技術(shù)及TUNEL實驗技術(shù)檢測槐耳對阿霉素耐藥細胞系231/Dox細胞凋亡的影響;并通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測槐耳對凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平及活化狀態(tài)的影響。研究結(jié)果:流式細胞學技術(shù)及TUNNEL檢測技術(shù)檢測結(jié)果顯示槐耳可增強阿霉素誘導的阿霉素耐藥細胞的凋亡;蛋白質(zhì)免疫印跡實驗顯示槐耳處理可調(diào)節(jié)細胞凋亡通路相關(guān)凋亡蛋白的表達,從而促進阿霉素耐藥乳腺癌細胞發(fā)生細胞凋亡。這些研究結(jié)果表明槐耳可促進乳腺癌阿霉素耐藥細胞的凋亡,從而抑制乳腺癌阿霉素耐藥。第三部分槐耳可抑制阿霉素耐藥細胞的藥物外排功能研究方法:我們利用鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein-AM)標記耐阿霉素乳腺癌細胞,檢測槐耳是否對阿霉素耐藥乳腺癌細胞(231/Dox)藥物外排功能產(chǎn)生的影響,并利用熒光檢測儀測量細胞內(nèi)的熒光強度。同時利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測P-gP蛋白在阿霉素耐藥細胞(231/Dox)及親代MDA-MB-231細胞內(nèi)的表達水平差異,并觀察槐耳是否能夠影響P-gP蛋白的表達。研究結(jié)果:熒光定量檢測結(jié)果顯示,槐耳短時間(30分鐘)處理乳腺癌阿霉素耐藥細胞并不能增加細胞內(nèi)的熒光強度;但耐藥細胞經(jīng)過長時間(24小時)的槐耳處理后,細胞內(nèi)的熒光強度可顯著增加。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果表明,與親代MDA-MB-231細胞相比,P-gP蛋白在阿霉素耐藥細胞系乳腺癌阿霉素耐藥乳腺癌細胞231/Dox中表達量顯著升高;耐藥細胞經(jīng)過槐耳處理后,P-gP蛋白的表達水平隨著槐耳濃度的增加及處理時間的延長而明顯下降。第四部分槐耳靶向AKT信號通路抑制乳腺癌阿霉素耐藥研究方法:通過AKT過表達載體構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、MTT實驗檢測AKT及AKT信號通路在阿霉素耐藥、細胞凋亡及P-gP表達中的作用;并通過上述實驗檢測槐耳是否能夠影響AKT及AKT信號通路。利用細胞轉(zhuǎn)染及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗觀察槐耳是否靶向作用于AKT及AKT/mTOR信號通路促進阿霉素耐藥細胞的凋亡并抑制P-gP蛋白表達量,從而抑制乳腺癌阿霉素耐藥。研究結(jié)果:過表達AKT可降低乳腺癌阿霉素耐藥細胞對阿霉素的敏感性,而槐耳則可逆轉(zhuǎn)AKT過表達所導致的阿霉素耐藥性的增加;進一步的蛋白質(zhì)免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)AKT的過表達可調(diào)節(jié)凋亡通路相關(guān)蛋白的表達,抑制細胞凋亡;并且過表達AKT還可上調(diào)P-gP轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平,從而增強細胞的藥物外排功能;與此同時,槐耳則可通過抑制AKT的表達水平,相應地活化凋亡通路,并下調(diào)P-gP轉(zhuǎn)運蛋白的表達量。結(jié)論:1.槐耳抑制乳腺癌阿霉素耐藥細胞的耐藥性。2.槐耳促進乳腺癌阿霉素耐藥細胞的凋亡;3.槐耳下調(diào)耐藥細胞P-gP轉(zhuǎn)運蛋白的表達并抑制乳腺癌阿霉素耐藥細胞的藥物外排功能;4.槐耳通過靶向作用于AKT信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥。意義:1、闡明了槐耳對乳腺癌阿霉素耐藥的抑制作用及其作用機制;2、證實了槐耳是乳腺癌化學療法的有效增敏劑,并能一定程度上抑制阿霉素耐藥,為乳腺癌臨床輔助治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊愛琳;胡仲冬;屠鵬飛;;槐耳抗腫瘤作用研究進展[J];中國中藥雜志;2015年24期

2 Ching-Ying Huang;Linda Chia-Hui Yu;;Pathophysiological mechanisms of death resistance in colorectal carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2015年41期

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本文編號：2651838