【摘要】：背景和目的:膽道癌(biliary tract cancer,BTC)是一組罕見于膽道系統(tǒng)的異質(zhì)性腫瘤,可分為膽囊癌(GallbladderNeoplasms)、肝內(nèi)膽管癌(iCCA)、肝門部膽管癌(pCCA)、遠(yuǎn)端膽管癌(dCCA)。在實(shí)際臨床工作中,該類疾病確診時(shí)分期較晚,5年生存率小于5%,外科手術(shù)是膽道癌可能獲得治愈的唯一治療方法,但可接受手術(shù)切除機(jī)會(huì)的患者不超過1/3,進(jìn)展期膽道癌患者的主要治療手段是系統(tǒng)化療,NCCN推薦順鉑聯(lián)合吉西他濱為一線化療方案,但療效差、生存期短。膽道癌目前無合適靶向治療藥物,阿帕替尼作為一種靶向VEGFR-2的小分子TKI,也可抑制c-Kit,Ret,PDGFR-β,以及c-src等酪氨酸激酶,CFDA于2014年12月批準(zhǔn)阿帕替尼可用于晚期胃腺癌或胃-食管結(jié)合部腺癌三線以上的治療,也發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌等腫瘤效果明顯,因此進(jìn)一步探索膽道癌的發(fā)病機(jī)制,尋求靶向治療具有深遠(yuǎn)意義。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)兩例治療后進(jìn)展的膽道癌患者經(jīng)阿帕替尼治療后,PFS6個(gè)月,顯示了阿帕替尼對(duì)膽道癌可喜的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)擬通過MTT試驗(yàn)、流式試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、transwell試驗(yàn)、克隆形成試驗(yàn)探討阿帕替尼對(duì)膽道腫瘤細(xì)胞系增殖、凋亡、遷移、侵襲及集落形成影響。通過Western blot初步檢測(cè)信號(hào)通路蛋白水平變化,分析可能作用的信號(hào)通路。希望為體內(nèi)試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ),為膽道腫瘤患者提供新的治療手段。方法:1.人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE細(xì)胞經(jīng)不同濃度阿帕替尼處理后,分別通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell侵襲試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、平板克隆形成試驗(yàn)分析膽道腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和集落形成能力;2.通過western blot試驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)不同濃度阿帕替尼處理后VEGFR2-RAS-RAF-MEK-ERK 通路、p-src、E-鈣粘蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、凋亡調(diào)節(jié)蛋白等相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1.人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE細(xì)胞在1-5d內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng),增殖率均增加,阿帕替尼可抑制其增殖,呈濃度依賴性,隨阿帕替尼濃度升高,抑制作用增強(qiáng);2.阿帕替尼可促進(jìn)人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、RBE細(xì)胞凋亡,呈濃度依賴性,隨阿帕替尼濃度升高,促凋亡作用均增加,但對(duì)膽管癌細(xì)胞Hccc-9810促凋亡作用不明顯;3.阿帕替尼可抑制人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE細(xì)胞侵襲、遷移,呈濃度依賴性,隨阿帕替尼濃度升高,抑制作用增加;4.阿帕替尼減少人膽道腫瘤細(xì)胞系集落形成,呈濃度依賴性,隨著阿帕替尼濃度升高,抑制作用增強(qiáng);5.阿帕替尼可下調(diào)人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE細(xì)胞p-VEGFR2表達(dá),進(jìn)而下調(diào)下游的信號(hào)p-ERK1/2、k-ras表達(dá),呈濃度依賴性,隨著阿帕替尼濃度的增加,抑制作用增強(qiáng),阿帕替尼通過VEGFR2-RAS-RAF-MEK-ERK途徑抑制增殖。6.人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE細(xì)胞存在p-src表達(dá)。阿帕替尼可上調(diào)E-鈣粘蛋白,下調(diào)p-src、基質(zhì)金屬蛋白酶,呈濃度依賴性,隨阿帕替尼濃度升高,抑制作用增強(qiáng)。表明阿帕替尼可通過靶向p-src后調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)量,最終達(dá)到抑制腫瘤侵襲、遷移。7.阿帕替尼可上調(diào)人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE細(xì)胞促凋亡蛋白p21、Bax、caspase3,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2,呈濃度依賴性,p53蛋白水平無明顯改變。結(jié)論:阿帕替尼可抑制人膽道腫瘤細(xì)胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、集落形成,促進(jìn)凋亡,可通過VEGFR-2/K-ras/RAF/MEK/ERK途徑抑制增殖,通過上調(diào)促凋亡蛋白p21、Bax、caspase3,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2達(dá)到促凋亡作用,通過上調(diào)E-鈣粘蛋白、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制侵襲、遷移。
【圖文】：

結(jié)果逡逑３．邋１阿帕替尼對(duì)膽道腫瘤細(xì)胞增殖的半抑制率（ＩＣ５０）測(cè)定逡逑以ＭＴＴ法檢測(cè)ＩＣ５０，每次試驗(yàn)設(shè)置３個(gè)平行組，重復(fù)４次，，阿帕替尼處理逡逑細(xì)胞２４ｈ，結(jié)果顯示阿帕替尼誘導(dǎo)膽道腫瘤細(xì)胞ＧＢＣ－ＳＤ、Ｈｃｃｃ－９８１０、ＲＢＥ半逡逑致死濃度分別為邋４０．邋９±１．邋９７＾ｉＭ、６７．邋７４±２．邋５３）ａＭ、５３．邋３６±２．邋８８｜＿ｉＭ邋（圖邋３－１）。三逡逑個(gè)細(xì)胞系對(duì)阿帕替尼的敏感程度由強(qiáng)到弱分別為ＧＢＣ－ＳＤ、ＲＢＥ、Ｈｃｃｃ－９８１０。根逡逑據(jù)此結(jié)果設(shè)定濃度梯度，以接近ＩＣ５０濃度為最高濃度，設(shè)置４個(gè)濃度梯度，設(shè)逡逑定阿帕替尼作用于ＧＢＣ－ＳＤ的濃度梯度為ＯｕＭ、１０ｕＭ、２０ｕＭ、４０ｕＭ；阿帕替逡逑尼作用于Ｈｃｃｃ－９８１０的濃度梯度為ＯｕＭ、１５ｕＭ、３０ｕＭ、６０ｕＭ；阿帕替尼作用于逡逑ＲＢＥ邋的濃度梯度為邋ＯｕＭ、１２．邋５ｕＭ、２５ｕＭ、５０ｕＭ。逡逑不同細(xì)胞系ＩＣ５０逡逑

后四個(gè)死亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、正常陰性細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞所占比率。逡逑表３－２－４表示不同濃度阿帕替尼作用于ＧＢＣ－ＳＤ、Ｈｃｃｃ－９８１０、ＲＢＥ后凋亡百逡逑分比的變化。圖３－３示阿帕替尼促進(jìn)膽道腫瘤ＧＢＣ－ＳＤ、Ｈｃｃｃ－９８１０、ＲＢＥ細(xì)逡逑胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 秦叔逵;李進(jìn);;阿帕替尼治療胃癌的臨床應(yīng)用專家共識(shí)[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2015年09期

2 王姍姍;劉明;劉英;汪選斌;;MTT法測(cè)定多柔比星和氟尿嘧啶及順鉑對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/ADM的IC_(50)值[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2010年05期

3 祝學(xué)光;膽管癌發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)展[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2002年05期

本文編號(hào)：2650027