【摘要】：結(jié)直腸癌又稱(chēng)為大腸癌(colorectal cancer,CRC),是全世界第三大常見(jiàn)癌癥。2014年美國(guó)新增CRC病例和CRC死亡的估計(jì)數(shù)分別約為135,000和50,000。早期診斷是結(jié)直腸癌最重要的預(yù)后影響因素,對(duì)于沒(méi)有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期疾病,5年存活率約為90%,但當(dāng)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí),存活率僅為10%。自20世紀(jì)80年代中期以來(lái),與許多其他西方國(guó)家相比我國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率有所下降,尤其是晚期疾病。盡管造成這種下降的原因尚不清楚,但CRC篩查的推廣可能是一個(gè)重要因素。結(jié)直腸癌家族史,炎癥性腸病和罕見(jiàn)遺傳病例如家族性腺瘤性息肉病和Lynch綜合征使得個(gè)體患CRC的風(fēng)險(xiǎn)增加。但是在沒(méi)有任何這些已知風(fēng)險(xiǎn)因素的所謂平均風(fēng)險(xiǎn)人群中CRC發(fā)病率逐年增高。在一般人群中,年齡是CRC最重要的危險(xiǎn)因素,90%以上的病例發(fā)生于50歲以上的個(gè)體。流行病學(xué)研究表明,生活方式的因素可能會(huì)影響CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),與風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)的因素包括紅肉和加工肉類(lèi)的高攝入量,吸煙,過(guò)度飲酒和肥胖,而體力活動(dòng)和使用阿司匹林與CRC風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。由于缺乏CRC預(yù)防的明確方式,篩查是目前降低CRC負(fù)擔(dān)最廣泛也最易接受的方法。近年來(lái),諸多研究者應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)等分子生物學(xué)技術(shù)針對(duì)結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了研究,目前已知的相關(guān)的分子標(biāo)志物例如:KRAS(抗EGFR抗體治療的預(yù)測(cè)標(biāo)記物)、B-Raf V600E(抗EGFR抗體抗性的生物標(biāo)志物)、PIK3CA、ERCC-1(奧沙利鉑的可能預(yù)測(cè)標(biāo)志物)、PTEN(CRC患者無(wú)進(jìn)展生存期較短相關(guān))、COX-2、Ezrin。蛋白質(zhì)組學(xué)的廣泛應(yīng)用使得人們對(duì)腫瘤的了解逐步加深。本研究在收集了結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本后,通過(guò)二維液相質(zhì)譜色譜發(fā)分析結(jié)直腸腺癌組織及配對(duì)的癌旁組織,分析質(zhì)譜數(shù)據(jù),建立差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜,本研究選取Cyp A作為目的蛋白,通過(guò)基因擴(kuò)增、載體構(gòu)建以期誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,制備Cyp A單克隆抗體,并對(duì)抗體進(jìn)行純化,鑒定;免疫組化驗(yàn)證Cyp A在組織中的差異表達(dá)并分析Cyp A的表達(dá)與相關(guān)的病例參數(shù)之間的關(guān)系。本研究共分為四部分:第一部分結(jié)直腸癌與癌旁組織的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究實(shí)驗(yàn)方法:1.選擇20例確診為T(mén)NMIII期腺癌且并未進(jìn)行治療的患的病變部位的癌組織樣本,及其附近10cm之外的癌旁組織。2.提取標(biāo)本總蛋白,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。3.制備蛋白水解多肽混合物。4.二維液相色譜法分離樣本。5.通過(guò)LTQ XL離子阱質(zhì)譜儀對(duì)二維色譜洗脫的多肽進(jìn)行檢測(cè)。6.對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,找到癌組織與癌旁組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果:1、經(jīng)分析,腫瘤組織中獲得了蛋白點(diǎn)357個(gè);癌旁組織中蛋白質(zhì)點(diǎn)獲得了243個(gè)。經(jīng)比對(duì),檢索,兩種組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)30個(gè)。2、上調(diào)表達(dá)蛋白(20個(gè)):Cyp A、ATP5B、TPM4、FGA、GSTP1、HIST1H3J、IGHA1、SERPINH1、TUBB3、IGHA1、TPM3、CKAP4、IGHA2、POSTN、FGB、FGG、PKM2、HIST1H2AE、MYH10和TUBB。3、下調(diào)表達(dá)蛋白(10個(gè)):SYNM、MYH11、PKM2、KRT10、FLNC、H2AFX、CAP1、MYL6、TUBB2A、TLN1。4、從差異表達(dá)蛋白譜中選取Cyp A為目標(biāo)蛋白展開(kāi)后續(xù)的研究。第二部分:Cyp A基因擴(kuò)增、載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白實(shí)驗(yàn)方法:1.基于Gen Bank-nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)里面的Cyp A基因序列,完成Cyp A基因的擴(kuò)增。2.連接Cyp A目的基因與p ET28a,構(gòu)建原核表達(dá)載體,使BL21細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變,由此獲取表達(dá)菌株BL21(7)DE3(8)(7)p ET28a/Cyp A(8)并誘導(dǎo)其表達(dá)。3.通過(guò)超聲讓菌體破碎,鎳瓊脂糖親和層析純化目的蛋白。4.SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白。5.Western bloting分析融合蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.順利創(chuàng)建p ET28a/Cyp A(原核表達(dá)質(zhì)粒),經(jīng)DNA測(cè)序,Gen Banknucleotide比對(duì),明確其為目的序列。2.完成轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)、純化,SDS-PAGE及Western bloting鑒定環(huán)節(jié)工作后,得到純化目的蛋白。第三部分Cyp A單克隆抗體制備、純化、鑒定實(shí)驗(yàn)方法:1.制備Cyp A蛋白免疫原,皮下注射免疫小鼠。取免疫小鼠脾臟,制備細(xì)胞,與骨髓瘤細(xì)胞融合。2.HAT選擇性培養(yǎng),ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株;3.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株腹水制備及腹水抗體效價(jià)檢測(cè);4.親和層析法純化腹水中單克隆抗體;5.SDS-PAGE分析純化的單克隆抗體,常染色體染色分析雜交瘤細(xì)胞核型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.得到1株穩(wěn)定分泌抗人Cyp A單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;2.抗體效價(jià)達(dá)1:160000,抗體純度達(dá)95%以上。第四部分Cyp A在組織中的差異表達(dá)及臨床病理參數(shù)分析實(shí)驗(yàn)方法:1.收集30對(duì)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織;2.根據(jù)病理診斷TNM分期將臨床病理資料分組;3.免疫組化法檢測(cè)Cyp A在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá),并分析Cyp A表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.通過(guò)免疫組化觀(guān)察到結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中均可檢測(cè)到Cyp A陽(yáng)性表達(dá),結(jié)直腸癌組織中表達(dá)率水平顯著高于癌旁組織。2.Cyp A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與結(jié)直腸癌的腫瘤分化水平及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān):在腫瘤伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中Cyp A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高。通過(guò)以上研究,我們得出以下結(jié)論:1.本研究成功建立了結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜。2.成功建立了Cyp A蛋白的雜交瘤細(xì)胞株,并進(jìn)行了純化與鑒定;同時(shí)制備了Cyp A蛋白的單克隆抗體,從而為后續(xù)的研究做好充分的準(zhǔn)備工作。3.驗(yàn)證了結(jié)直腸癌組織中Cyp A的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。4.分析了Cyp A蛋白與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的關(guān)系,為判斷結(jié)直腸癌疾病的發(fā)展提供了潛在的依據(jù)。
【圖文】：

CYPA蛋白的質(zhì)譜鑒定:AGPNTNGSQFFIC}CAM}TAK序列膚段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

CYPA蛋白的質(zhì)譜鑒定:EGMNIVEAMER序列膚段的串聯(lián)質(zhì)譜圖
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Woo-Jeong Jeong;Pu-Hyeon Cha;Kang-Yell Choi;;Strategies to overcome resistance to epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy in metastatic colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年29期

2 ;Next generation of antibody therapy for cancer[J];癌癥;2011年05期

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本文編號(hào)：2649005