【摘要】：目的:星形細胞腫瘤具有浸潤性生長及易復(fù)發(fā)等特點。盡管神經(jīng)外科手術(shù)以及術(shù)后放療、化療技術(shù)有了顯著的進步,但星形細胞腫瘤患者的中位生存時間未得到明顯延長。近年來,基因靶向治療在治療腫瘤等疾病中發(fā)揮了重要作用。與此同時,靶向星形細胞腫瘤的基因治療也在臨床中顯示良好的應(yīng)用前景。DEK是一類原癌基因,在急性髓細胞白血病中首次被發(fā)現(xiàn)。EDK還在其他多種惡性腫瘤中高表達,如肝細胞癌、喉鱗癌及惡性黑色素瘤等。高表達的DEK促進腫瘤的惡性生物學(xué)行為,并介導(dǎo)惡性黑色素瘤的抗藥性。目前尚無文獻報道DEK在不同病理級別的星形細胞腫瘤中的表達水平。同時,未見文獻報道DEK是否可以調(diào)控星形細胞腫瘤細胞的生物學(xué)行為及可能的調(diào)控機制。本研究目的在于從分子水平檢測星形細胞腫瘤中DEK基因的mRNA和蛋白的表達水平,分析其表達水平與星形細胞腫瘤WHO病理級別的關(guān)系,探討其在星形細胞腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為中的調(diào)控作用,從而為星形細胞腫瘤的基因靶向治療提供實驗依據(jù)。方法1、應(yīng)用RT-PCR法檢測DEK mRNA在星形細胞腫瘤組織中的表達水平。2、應(yīng)用Western blot法檢測DEK蛋白在不同病理級別的星形細胞腫瘤臨床樣本中的表達水平。3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測DEK蛋白在星形細胞腫瘤組織中的分布和表達。4、RT-PCR法檢測經(jīng)小干擾RNA(Small interefering RNA,siRNA)基因沉默后,DEK mRNA在U251細胞中表達水平的變化。5、Western blot法檢測經(jīng)siRNA基因沉默后,DEK蛋白在U251細胞中表達水平的變化。6、檢測DEK基因沉默后對于U251細胞生長能力的影響。7、檢測DEK基因沉默后對于U251細胞凋亡和細胞周期的作用。8、應(yīng)用Western blot法檢測DEK基因沉默后,U251細胞中P53、P21、Bcl-2和C-myc蛋白質(zhì)表達水平的變化。9、檢測DEK基因沉默對于U251細胞內(nèi)Caspase-3活性的影響。結(jié)果1、DEK mRNA和蛋白在正常腦組織中表達水平極低,而在星形細胞腫瘤組織中表達水平增高,其表達水平與星形細胞腫瘤WHO病理級別正相關(guān),高級別星形細胞腫瘤(III、IV級)中DEK的表達水平顯著高于低級別星形細胞腫瘤(I、II級)。2、DEK在星形細胞腫瘤臨床樣本中的陽性率顯著高于其在正常腦組織臨床樣本中的陽性率,DEK蛋白主要分布于星形細胞腫瘤的細胞核中,隨著腫瘤病理級別的增高,DEK表達強度增強,低級別組與高級別組間有顯著差異。3、siRNA-DEK轉(zhuǎn)染的U251細胞中DEK mRNA和蛋白表達水平顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組,陰性對照組與未轉(zhuǎn)染組DEK mRNA和蛋白表達水平無顯著性差異。4、siRNA-DEK轉(zhuǎn)染24h后,U251細胞的生長速率開始顯著下降,72h達到最低,未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組間細胞生長速率無顯著性差異。5、siRNA-DEK轉(zhuǎn)染后,U251細胞的凋亡率顯著高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組,U251細胞增殖指數(shù)顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組。6、siRNA-DEK轉(zhuǎn)染后,U251細胞內(nèi)P53和P21蛋白表達顯著上調(diào),Bcl-2、C-myc蛋白表達下調(diào),而在未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組表達無明顯改變。7、與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比,siRNA-DEK轉(zhuǎn)染組U251細胞中Caspase-3活性顯著升高。討論針對星形細胞腫瘤的靶向治療主要包括以下幾個方面:干擾腫瘤細胞的細胞周期進程、促進腫瘤細胞凋亡;應(yīng)用前藥轉(zhuǎn)換酶的靶向治療;應(yīng)用免疫方法增強機體對腫瘤細胞的免疫識別能力。其中,選擇適宜的基因靶點是其中最為關(guān)鍵的一步。研究發(fā)現(xiàn)DEK原癌基因在多種腫瘤中呈高表達狀態(tài),但尚未見有關(guān)DEK在星形細胞腫瘤組織中表達水平的文獻報道。在本研究中,首先檢測DEK蛋白在星形細胞腫瘤臨床樣本中的分布與表達,實驗結(jié)果顯示:與正常腦組織相比,DEK蛋白在星形細胞腫瘤臨床樣本中顯著高表達,并與腫瘤WHO病理級別正相關(guān)。DEK主要分布于星形細胞腫瘤的細胞核中。為了進一步證實以上關(guān)于DEK在星形細胞腫瘤組織中表達水平的研究結(jié)果,我們采用siRNA-DEK轉(zhuǎn)染U251細胞,檢測DEK基因沉默對其生物學(xué)特性的影響。實驗結(jié)果顯示:在siRNA-DEK轉(zhuǎn)染組,DEK mRNA和蛋白表達水平顯著降低,細胞的生長速率顯著下降,細胞增殖指數(shù)顯著降低,細胞的凋亡率則顯著增高。說明DEK基因表達下調(diào)能夠抑制星形細胞瘤細胞系體外增殖能力,使細胞生長受抑,生長速度減緩,提示DEK與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,可以作為腫瘤基因治療的候選靶點。同時,我們還發(fā)現(xiàn),siRNA-DEK干擾DEK表達后,凋亡抑制基因Bcl-2受抑,p53及其下游調(diào)控基因p21表達均上調(diào),活化Caspase-3誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡,表明p53依賴性細胞凋亡途徑在DEK原癌基因調(diào)控星形細胞腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DEK基因沉默后,C-myc蛋白表達也明顯下調(diào),表明DEK可能通過反式激活作用來激活c-myc癌基因參與細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。結(jié)論1、DEK mRNA和蛋白在星形細胞腫瘤中表達上調(diào),其陽性率及表達水平均與星形細胞腫瘤WHO病理級別正相關(guān);2、利用基因沉默技術(shù)設(shè)計合成的靶向siRNA-DEK,能有效地在U251星形細胞瘤細胞內(nèi)實現(xiàn)基因沉默效應(yīng);3、siRNA-DEK下調(diào)DEK基因表達后,U251細胞生長減慢,細胞凋亡增加,細胞增殖受抑;4、siRNA-DEK下調(diào)DEK基因表達后,凋亡抑制基因Bcl-2受抑,p53及其下游調(diào)控基因p21表達均上調(diào),Caspase-3活性增加;5、DEK基因下調(diào)引起的p53和p21轉(zhuǎn)錄激活可負調(diào)節(jié)細胞周期,使U251細胞周期阻抑;6、siRNA-DEK下調(diào)DEK基因表達后,C-myc蛋白表達也明顯下調(diào),表明DEK可能通過反式激活作用來激活c-myc癌基因參與細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。
【圖文】：

RT-PCR 法檢測 DEK mRNA 的表達變化。（M：分子量標志；1~5 高級別星形細胞腫瘤組織；6~10 低級別星形細胞腫瘤組織；11~13 正常腦組織）3.2 Western blot 檢測 DEK 蛋白的表達水平在正常腦組織中未檢測到 DEK蛋白表達，全部星形細胞腫瘤組織中均有 DEK蛋白表達，其表達強度隨星形細胞腫瘤級別增加而增加，，低級別星形細胞腫瘤組織 DEK 蛋白的相對含量(DEK IDV/β-actin IDV)為 0.55±0.11，高級別星形細胞腫瘤為 0.85 ±0.07，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)（見表 1.2，圖 1.2）。表 1.2，DEK 蛋白在正常腦組織和星形細胞腫瘤組織中的表達總例數(shù)（n）陽性例數(shù)（n）DEK 相對含量DEK IDV/β-actin IDV

Western blot 法檢測 DEK 蛋白的表達。（1~5 高級別星形細胞腫瘤組織；6~10 低級別星形細胞腫瘤組織；11~13 正常腦組織）3.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測 DEK 蛋白在各組組織中的分布和表達DEK 蛋白主要定位于星形細胞的細胞核內(nèi)， 32 例星形細胞腫瘤組織中 31 例DEK 蛋白陽性，陽性表達率為 96.88%，5 例正常腦組織中 2 例為弱陽性表達，陽性表達率為 40.00%；DEK 蛋白陽性細胞百分率分別為：正常腦組織 35.96±5.70%，低級別星形細胞腫瘤組織 51.59±9.66%，高級別星形細胞腫瘤組織 88.31±5.58%，組間表達差異均具有顯著性意義 (P<0.05)（具體結(jié)果見表 1.3~1.4，圖 1.3~1.6）。表 1.3，免疫組化檢測 DEK 蛋白在正常腦組織和星形細胞腫瘤組織中的表達組織例數(shù)表達強度（n） 陽性率陽性細胞
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2

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本文編號：2648293