【摘要】：肝臟細(xì)胞色素P450氧化酶(CYP450)參與70%～80%臨床藥物的代謝。CYP450活性的個(gè)體差異是導(dǎo)致藥物代謝、藥物效應(yīng)及毒性存在較大個(gè)體差異的主要原因。肝細(xì)胞癌(HCC)患者生理、生化(肝臟功能、肝血流量、具有功能的肝臟大小、血漿蛋白結(jié)合率等)的改變會(huì)影響CYP450的活性,進(jìn)而導(dǎo)致藥物清除率發(fā)生變化。因此,確定正常人及HCC患者CYP450的活性、個(gè)體差異及影響因素是個(gè)體化用藥的重要前提。HCC是我國常見的惡性腫瘤之一,死亡率位居惡性腫瘤前列,發(fā)現(xiàn)時(shí)大多在中晚期,至今尚缺乏有效的治療方案。亞硝胺類化合物是目前公認(rèn)的前致癌物,經(jīng)CYP2E1代謝活化生成致癌物而引發(fā)腫瘤。食物中亞硝胺類的含量與HCC的發(fā)生密切相關(guān),但同樣食用高亞硝胺含量的食物,有人發(fā)展成HCC,有人卻很安全。推測CYP2E1代謝活性存在較大個(gè)體差異是HCC易感性表現(xiàn)出顯著個(gè)體差異的原因。本研究以正常肝標(biāo)本為研究對象,探究人肝10種CYP450生理活性的相關(guān)性及個(gè)體內(nèi)差異;以CYP2D6為例,闡明其不同水平活性表型間的關(guān)系及基因型對不同水平活性表型的影響。以HCC患者非腫瘤肝組織為研究對象,分析10種CYP450不同水平的活性及影響因素;測定CYP2E1代謝二乙基亞硝胺的活性,考察CYP2E1活性、臨床指標(biāo)對HCC切除術(shù)患者生存期的影響。以DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型為研究對象,探究CYP2E1先天活性及CYP2E1抑制活性與HCC的相關(guān)性。通過上述研究,以求為正常人及HCC患者個(gè)體化用藥提供更精準(zhǔn)的指導(dǎo);以期發(fā)現(xiàn)HCC防治新靶點(diǎn),為HCC的早防早治提供新的策略。1方法1.1人肝標(biāo)本收集105例肝功能正常人肝標(biāo)本及102例HCC患者非腫瘤肝標(biāo)本。研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)生命倫理審查委員會(huì)審查通過,肝標(biāo)本供體簽署知情同意書。1.2肝微粒體蛋白濃度及含量測定低溫差速離心法制備人肝微粒體(HLMs)。Bradford法測定HLMs蛋白濃度。肝微粒體蛋白含量(MPPGL)通過測定肝組織勻漿及HLMs中細(xì)胞色素P450氧化還原酶(POR)的活性確定。1.3 CYP450活性測定孵育體系包含HLMs、不同濃度的探針?biāo)幬�、磷酸鹽緩沖液及NADPH。高效液相色譜法測定 10 種 CYP450(CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4/5)代謝產(chǎn)物的生成量。通過非線性回歸分析方法(GraphPad Prism 5.04)計(jì)算CYP450的肝微粒體水平清除率(CLM)。采用體外-體內(nèi)外推法推算CYP450其他水平的清除率(肝組織水平,CLLT;肝臟水平,CLL;整體水平,CLH)。1.4 CYP450CLM的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析2種CYP450CLM間的相關(guān)性。采用層次聚類分析10種CYP450 CLM間的相關(guān)性。采用多重線性回歸分析1種CYP450 CLM與其余CYP450 CLM之間的數(shù)量依存關(guān)系。1.5 CYP2D6蛋白含量測定將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的CYP2D6特異性肽段整合在一個(gè)QconCAT蛋白序列中,采用穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)-多反應(yīng)監(jiān)測-質(zhì)譜技術(shù)(SID-MRM-MS)對其定量。1.6 CYP450探針?biāo)幬锏娜梭w藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)收集在PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索自1975年至2016年關(guān)于CYP450探針?biāo)幬锏娜梭w藥代動(dòng)力學(xué)的文獻(xiàn)。1.7 CYP450基因多態(tài)性測定通過SNP MassARRAY方法檢測中國人群的10種CYP450發(fā)生頻率大于1%的基因多態(tài)性位點(diǎn)。1.8 HCC患者術(shù)后隨訪采用電話隨訪為主、登門隨訪為輔的方式進(jìn)行隨訪。自切除術(shù)后,每隔6個(gè)月隨訪一次,隨訪歷時(shí)42～54個(gè)月。1.9大鼠肝癌模型建立實(shí)驗(yàn)開始前4周,每周給予大鼠腹腔注射兩次二乙基亞硝胺(DEN,50 mg/kg),第5到14周每周給予大鼠腹腔注射一次DEN(50 mg/kg)。喂養(yǎng)到第19周處死全部大鼠,記錄并測量肝臟表面結(jié)節(jié)(≥ 5 mm)個(gè)數(shù)、大小。留取部分肝臟標(biāo)本固定于福爾馬林溶液中,剩余肝標(biāo)本凍存于液氮中備用。1.10大鼠CYP2E1先天活性及抑制活性測定CYP2E1先天活性系指肝癌模型建立前(第0周)健康大鼠CYP2E1代謝DEN的活性;CYP2E1抑制活性系指肝癌模型建立前(第0周)健康大鼠腹腔注射CYP2E1抑制劑氯美噻唑(CMZ)后CYP2E1代謝DEN的活性。測定大鼠腹腔注射DEN(50 mg/kg)的毒代動(dòng)力學(xué),確定大鼠CYP2E1的先天活性;腹腔注射CMZ后立即腹腔注射DEN(50 mg/kg),測定大鼠DEN的毒代動(dòng)力學(xué),確定大鼠CYP2E1的抑制活性。毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用藥物和統(tǒng)計(jì)學(xué)DAS 3.2.6軟件(中國藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì),上海)處理。1.11組織病理及免疫組化分析分別用HE和Masson對切片染色,根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)對HE染色的病理結(jié)果進(jìn)行評分。通過免疫組化方法,分別用Anti-Ki67抗體及Anti-PCNA抗體檢測肝組織中Ki67+細(xì)胞數(shù)及PCNA+細(xì)胞數(shù)。1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS17.0 software package(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Adobe Photoshop CC 2014(Adobe,San Jose,CA,USA)和 GraphPad Prism 5.04 software package(GraphPad Inc.,La Jolla,CA,U.S.A.)進(jìn)行作圖。2 結(jié)果2.1人肝10種CYP450生理活性2.1.1 CYP450 CLM 的相關(guān)性兩種CYP450 CYP1A2及CYP2B6分別與4種CYP450存在相關(guān)性;CYP2C8、CYP2C9 及 CYP2E1 分別與 3 種 CYP450 存在相關(guān)性;CYP2C19 及CYP2D6分別與2種CYP450存在相關(guān)性;CYP3A4/5僅與CYP2C19存在相關(guān)性;CYP2A6與其他CYP450均不存在相關(guān)性。其中CYP2C8與CYP2C9的相關(guān)性最好(r = 0.485,P=1.62E-07),其次為 CYP1A2 與 CYP2C9(r = 0.400,P= 2.39E-05)。多種CYP450若將10種CYP450聚成2類,則第一類包括:CYP2C8、CYP2C9、CYP1A2 和 CYP2B6,第二類包括:CYP2A6、CYP2D6、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5;若將10種CYP450聚成4類,則第一類包括:CYP2C8和CYP2C9,第二類包括:CYP1A2和CYP2B6,第三類包括:CYP2A6和CYP2D6,第四類包括:CYP2C19、CYP2E1 和 CYP3A4/5。根據(jù) 10 種 CYP450 CLm 間存在的數(shù)量依存關(guān)系,可以通過CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9和CYP2C19的CLm推算出 CYP2A6、CYP2C8、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4/5 的 CLM。2.1.2 CYP450CLM的個(gè)體內(nèi)差異個(gè)體內(nèi)差異10種CYP450的CLM存在較大的個(gè)體內(nèi)差異(變異系數(shù),ICV),不同個(gè)體的ICV不同。其中ICV較大者(ICV100%)5例,占比4.8%;ICV 中等者(50%ICV≤100%)55 例,占比 52.8%;ICV 較小者(ICV50%)45例,占比42.9%。影響因素性別、飲酒對個(gè)體內(nèi)差異無顯著影響;年齡通過影響CYP3A4/5的CLM而影響個(gè)體內(nèi)差異;吸煙通過影響CYP1A2、CYP2C9和CYP2D6的CLM而影響個(gè)體內(nèi)差異;CYP2A6*4、CYP2B6 15631GT、CYB618053AG、CYP2C942614AC、CYP2D6 100CT、1661GC 和CYP2D6 2850GA 通過影響其CLM而影響個(gè)體內(nèi)差異。2.1.3 CYP2D6基因型及其活性表型基因型正常人CYP2D6 100CC、CYP2D6 100CT和CYP2D6 100TT的基因頻率分別為 31.1%、22.2%和 46.7%。CYP2D6 1661GG、CYP2D6 1661GC和CYP2D6 1661CC 的基因頻率分別為 50.6%、37.1%和 12.3%。基因型對不同水平活性表型的影響不同水平的活性表型系指分子活性表型(CLP)、亞細(xì)胞活性表型(CLM)、組織活性表型(CLLT)、器官活性表型(CLL)、整體活性表型(CLH)。一般,CYP2D6 100CT突變導(dǎo)致各個(gè)水平的活性表型降低,而CYP2D61661GC突變導(dǎo)致各個(gè)水平的活性表型升高。與100CC個(gè)體相比,100TT個(gè)體的CLP降低30.0%。與1661GG個(gè)體相比,1661GC個(gè)體的CLP增加2.00倍,而1661CC個(gè)體的CLP增加1.66倍。與100CC個(gè)體相比,100CT個(gè)體的CLM、CLLT、CLL均降低約20.0%,100TT個(gè)體的CLM、CLLLT、CLL均降低約70.0%。與1661GG個(gè)體相比,1661GC個(gè)體的CLM、CLLLT、CLL均增加約3.15 倍,而1661CC 個(gè)體的 CLm、CLLT和 CLL 分別增加 3.10、3.75 和 4.17 倍。與100CC個(gè)體相比,100CT個(gè)體的CLH降低18.6%,100TT個(gè)體的CLH降低70.4%。與166GG個(gè)體相比,1661GC個(gè)體的CLH增加3.28倍,而1661CC個(gè)體的CLH增加3.69倍。2.2 HCC患者10種CYP450不同水平的清除率2.2.1清除率改變與對照組相比,3種CYP450(CYP2C9、CYP2D6及CYP2E1)的CLM顯著增高,3 種 CYP450(CYP1A2、CYP2C8 及 CYP2C19)的 CLM 顯著降低,而 4種 CYP450(CYP2A6、CYP2B6 及 CYP3A4/5)的 CLm 基本不變。10 種 CYP450 CLLT、CLL及CLH的變化趨勢一致,但變化率不同。僅CYP2E1的CLLT、CLL及 CLH 顯著增高,7 種 CYP450(CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19及 CYP3 A4/5)的 CLLT、CLL 及 CLH 顯著降低,2 種 CYP450(CYP2C9 及 CYP2D6)的CLLLT、CLL及CLH基本不變。2.2.2影響因素肝微粒體水平女性CYP2A6的CLM顯著高于男性;年齡對CLM無顯著影響;吸煙者及飲酒者CYP2D6的CLM均顯著降低;CYP1A2-163CA、CYP2C942614AC、CYP2D6100CT、CYP2D61846GA 及 CYP3A5 6986AG 突變使其CLm顯著降低。肝組織水平性別及年齡對CLLT無顯著影響;吸煙者及飲酒者CYP2D6的CLLT均顯著降低;CYP2C9 42614AC、CYP2D6 100T、CYP2T6 1846GA、CYP2E及-333TA及CYP3A5 698G突變使其 CLLT 顯著降低。肝臟水平性別及年齡對CLL無顯著影響;吸煙者及飲酒者CYP2D6的CLL均顯著降低CYP2C9 42614AC、CYP2D6 100CT、CYP2D6 1846GA、CYP2E1-333TA及CYP3A5 6986AG突變使其CLL顯著降低。整體水平性別及年齡對CLH無顯著影響;吸煙者及飲酒者CYP2D6的CLL均顯著降低;CYP2C942614AC、CYP2D6100CT、CYP2D61846GA、CYP2E1-333TA及CYP3A56986AG突變使其CLH顯著降低。2.3 CYP2E1與HCC相關(guān)性2.3.1 CYP2E1 代謝 DEN 活性與 HCC活性改變以CYP2E1代謝DEN的轉(zhuǎn)化率(VDEN)表示CYP2E1代謝DEN的活性。HCC患者VDEN顯著升高,增加了 109.4%。采用百分位數(shù)法(單側(cè),95%)確定正常參考值。與正常參考值相比,30(42.8%)例HCC患者的VDEN為陽性。影響因素性別、年齡及臨床病理特征[甲胎蛋白(AFP)、肝硬化、最大腫瘤直徑、病灶個(gè)數(shù)、腫瘤分級及門靜脈癌栓]對VDEN無顯著影響;CYP2E1-333TA基因多態(tài)性位點(diǎn)顯著影響其VDEN,-333AA個(gè)體較-333TA個(gè)體的VDEN顯著升高。2.3.2 CYP2E1活性與生存期總體生存時(shí)間死亡患者平均生存時(shí)間為397天,95%置信區(qū)間為319～475天;中位生存時(shí)間為306天,95%置信區(qū)間為237～365天。影響生存期的單因素性別、年齡、AFP(20ng/mL)、肝硬化、最大腫瘤直徑、病灶個(gè)數(shù)、腫瘤分級、門靜脈癌栓及CYP2E1基因多態(tài)性位點(diǎn)均對生存時(shí)間無顯著影響;VDEN陰性者較VDEN陽性者生存期顯著延長,延長了 114.4%;AFP≤600ng/mL者較600ng/mL者生存期顯著延長,延長了 69.8%。影響生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素VDEN和最大腫瘤直徑是影響HCC患者生存的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。HCC患者的VDEN越高、腫瘤越大,其生存期越短。2.3.3 CYP2E1先天活性與DEN所致大鼠肝癌的相關(guān)性對肝癌發(fā)生率的影響低半衰期(t1/2)組與高t1/2組的肝癌發(fā)生率無顯著差異(77.8%vs52.6%);低時(shí)間曲線下面積(AUC0-t)組較高AUC0-t組的肝癌發(fā)生率顯著升高(83.3%vs47.4%);高表觀清除率(CL/F)組較低CL/F組的肝癌發(fā)生率顯著升高(84.2%vs 44.4%)。對肝癌嚴(yán)重程度的影響具有較短t1/2大鼠的最大腫瘤直徑及累積腫瘤直徑比具有較長t1/2大鼠的顯著增大,且t1/2與上述指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān);具有較低AUC0-t大鼠的最大腫瘤直徑、累積腫瘤直徑、最大腫瘤體積及累積腫瘤體積比具有較高AUC0-t大鼠的顯著增大,且AUC0-t與上述指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān);具有較高CL/F大鼠的結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)、最大腫瘤直徑、累積腫瘤直徑、最大腫瘤體積及累積腫瘤體積比具有較低CL/F大鼠的顯著增多(增大),且CL/F與上述指標(biāo)均呈正相關(guān)。2.3.4 CYP2E1抑制活性與DEN所致大鼠肝癌的相關(guān)性對肝癌發(fā)生率的影響模型組、CMZ低劑量組和CMZ高劑量組肝癌發(fā)生率分別為64.9%、58.0%和10.0%,CMZ高劑量組的肝癌發(fā)生率顯著低于模型組。對肝癌嚴(yán)重程度的影響CMZ高劑量組的結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)、最大腫瘤直徑、累積腫瘤直徑、最大腫瘤體積、累積腫瘤體積、Ki67+細(xì)胞數(shù)和PCNA+細(xì)胞數(shù)均較模型組顯著降低。結(jié)論1.通過CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9和CYP2C19的肝微粒體水平清除率可推算出 CYP2A6、CYP2C8、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4/5 的清除率。2.正常人肝微粒體10種CYP450的清除率存在較大的個(gè)體內(nèi)差異。年齡、吸煙、CYP2A6*4、CYP2B615631GT、CYP2B618053AG、CYP2C942614AC、CYP2D6100CT、CYP2D61661GC、CYP2D62850GA可顯著影響個(gè)體內(nèi)差異。3.CYP2D6特定基因型顯著影響其在不同水平(分子、亞細(xì)胞、組織、器官、整體)的活性表型,且影響程度不同。4.肝癌患者不同水平的CYP2E1清除率均較正常人顯著升高,且肝癌患者CYP2E1活性與生存期呈負(fù)相關(guān)。5.大鼠CYP2E1先天活性與二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌呈因果關(guān)系,CYP2E1非特異性抑制劑可降低肝癌發(fā)生率。
【圖文】：

ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ邋ＣＬｍ邋ｄｉｖｉｄｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｍｅｄｉａｎ邋ｆｏｒ邋ｔｈａｔ邋ＣＹＰ４５０．逡逑４．３．２活性強(qiáng)度逡逑按照１０種ＣＹＰ４５０相對ＣＬＭ高低進(jìn)行排序并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖４．４），結(jié)果逡逑發(fā)現(xiàn)，ＣＹＰ２Ｄ６的相對ＣＬＭ最高，，其較ＣＹＰ２Ａ６的相對ＣＬＭ顯著升高，而與其逡逑余ＣＹＰ４５０無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。逡逑３－１邐￥逡逑Ｊ邋２－邋Ｔ逡逑１邋ｉｉｓｉｍｉｊ逡逑０ＩＭ：邋ｉ邋Ｍ邋？邋＾邐１邋ｊ邋Ｉ逡逑圖４．４正常肝微粒體１０種ＣＹＰ４５０的活性強(qiáng)度（ｎ＝邋１０５）。逡逑Ｔｈｅ邋ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ邋ｏｆ邋ＣＬｍ邋ｆｏｒ邋１０邋ＣＹＰ４５０邋ｉｎ邋ｎｏｒｎｉａｌ邋ｈｕｍａｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ邋（ｎ＝１０５）．邋＊邋Ｐ邋＜邋０．０５，逡逑ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｔｏ邋ＣＹＰ２Ａ６．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋ｗｉｔｈ邋Ｓ．Ｄ．邋Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｗａｓ邋ｐｅ

邐＾邋＾逡逑ＩＣＶ逡逑圖４．３正常肝微粒體（ｎ＝１０５）邋１０種ＣＹＰ４５０相對清除率的變異系數(shù)。逡逑Ｔｈｅ邋ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｉｎｔｒａ－ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ邋ｏｆ邋ｖａｒｉａｔｉｏｎ邋（ＩＣＶ）邋ｆｏｒ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ逡逑ＣＬｍ邋ｏｆ邋１０邋ＣＹＰ４５０邋ｉｎ邋ｎｏｒｎｉａｌ邋ｈｕｍａｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ邋（ｎ＝１０５）．邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ＣＬｍ邋ｗａｓ邋ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ邋ａｓ逡逑ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ邋ＣＬｍ邋ｄｉｖｉｄｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｍｅｄｉａｎ邋ｆｏｒ邋ｔｈａｔ邋ＣＹＰ４５０．逡逑４．３．２活性強(qiáng)度逡逑按照１０種ＣＹＰ４５０相對ＣＬＭ高低進(jìn)行排序并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖４．４），結(jié)果逡逑發(fā)現(xiàn)，ＣＹＰ２Ｄ６的相對ＣＬＭ最高，其較ＣＹＰ２Ａ６的相對ＣＬＭ顯著升高，而與其逡逑余ＣＹＰ４５０無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。逡逑３－１邐￥逡逑Ｊ邋２－邋Ｔ逡逑１邋ｉｉｓｉｍｉｊ逡逑０ＩＭ：邋ｉ邋Ｍ邋？邋＾邐１邋ｊ邋Ｉ逡逑圖４．４正常肝微粒體１０種ＣＹＰ４５０的活性強(qiáng)度（ｎ＝邋１０５）。逡逑Ｔｈｅ邋ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ邋ｏｆ邋ＣＬｍ邋ｆｏｒ邋１０邋ＣＹＰ４５０邋ｉｎ邋ｎｏｒｎｉａｌ邋ｈｕｍａｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ邋（ｎ＝１０５）．邋＊邋Ｐ邋＜邋０．０５，逡逑ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｔｏ邋ＣＹＰ２Ａ６．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋ｗｉｔｈ邋Ｓ．Ｄ．邋Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｕｓｉｎｇ逡逑ｔｈｅ邋ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶ
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7


本文編號：2645818