【摘要】：目的:前期實驗研究發(fā)現(xiàn),通過相應(yīng)的激動劑、抑制劑調(diào)節(jié)TRPV6蛋白及mRNA的表達,可以使結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)Ca~(2+)水平發(fā)生相應(yīng)的變化,從而影響結(jié)腸癌SW480細胞的增殖、遷移及其凋亡。我們通過觀察沉默TRPV6基因后對結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度變化和生物學行為的影響以及TRPV6對SD大鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響,希望能夠進一步探索TRPV6在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的相關(guān)機制及作用,為結(jié)腸癌的預(yù)防及治療尋找新的機制及治療靶點。方法:(1)TRPV6基因沉默對結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)鈣和生物學行為的影響:利用上海吉凱公司設(shè)計TRPV6干擾序列,片段合成后構(gòu)建慢病毒RNA干擾(RNA interference,RNAi)表達載體,隨后將其包裝成成熟慢病毒顆粒去感染結(jié)腸癌SW480細胞,經(jīng)嘌呤霉素抗性選擇培養(yǎng)后,建立穩(wěn)定表達TRPV6-RNAi的SW480細胞株,通過免疫組化法、Western-Bolt、PCR技術(shù)驗證其轉(zhuǎn)染成功并有效抑制TRPV6蛋白及mRNA的表達,并用細胞增殖實驗(MTT比色法)、細胞劃痕及細胞凋亡實驗觀察TRPV6基因沉默后對結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)Ca~(2+)的濃度變化和對其增殖、遷移及凋亡的影響。(2)TRPV6對SD大鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響:選用SD大鼠55只,隨機分為5組,其中干預(yù)組每組10只(分別為DMH+1,25(OH)_2D_3組、DMH+CaCl_2組、DMH+CuCl_2組),DMH組15只,對照組10只。DMH+1,25(OH)_2D_3組每周予以DMH(20mg/kg)腹腔注射,同時予以1,25(OH)_2D_3 37.5nmol/kg灌胃,隔日一次;DMH+CaCl_2組每周予以DMH(20mg/kg)腹腔注射,同時予以CaCl_2 37.5mmol/kg灌胃,隔日一次;DMH+CuCl_2組予以DMH(20mg/kg)每周一次腹腔注射,同時予以CuCl_2 375umol/kg灌胃,隔日一次;DMH組每周僅予以DMH(20mg/kg)腹腔注射,并予相同劑量的生理鹽水灌胃;對照組腹腔注射相同劑量的生理鹽水,每周一次,同時予同等劑量的生理鹽水灌胃,分別在第18周、20周及22周處死一批老鼠。通過HE染色了解模型構(gòu)建情況,Western-Blot印跡方法檢測各組大腸中TRPV6蛋白的表達。結(jié)果:(1)TRPV6-RNAi組能夠下調(diào)結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度,與兩對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);(2)TRPV6-RNAi組能夠抑制結(jié)腸癌SW480細胞的增殖、遷移并誘導其凋亡,與兩對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)對照組大鼠大腸均未見腫瘤發(fā)生,實驗組及干預(yù)組存活的37只大鼠中有25只大鼠成功誘發(fā)大腸腫瘤,成瘤率為67.6%,其中DMH+1,25(OH)_2D_3組的成瘤率為100%,DMH組的成瘤率為84.62%,DMH+CaCl_2組的成瘤率為50%,DMH+CuCl_2組的成瘤率為33.33%。(4)通過Western Blot印跡方法檢測TRPV6蛋白在各組中均有表達,DMH組、DMH+1,25(OH)_2D_3組、DMH+CaCl_2組、DMH+CuCl_2組TRPV6蛋白的表達均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);DMH組TRPV6蛋白的表達高于DMH+CaCl_2組、DMH+CuCl_2組,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而DMH+CaCl_2組與DMH+CuCl_2組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);DMH組+1,25(OH)_2D_3組TRPV6蛋白的表達高于DMH組,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:(1)TRPV6-RNAi轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞后,使結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度降低,并抑制結(jié)腸癌SW480細胞增殖、遷移及誘導其凋亡。(2)1,25(OH)_2D_3可以使實驗鼠結(jié)腸組織TRPV6蛋白表達增加,并促進結(jié)腸腫瘤的形成。(3)CaCl_2、CuCl_2可以使實驗鼠結(jié)腸組織TRPV6蛋白表達降低,并抑制結(jié)腸腫瘤的形成。
【圖文】：

遵義醫(yī)學院碩士學位論文 謝2 實驗結(jié)果2.1 TRPV6-RNAi 轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌 SW480 細胞后形態(tài)的變化在倒置顯微鏡下觀察 TRPV6-RNAi 轉(zhuǎn)染 72h 后結(jié)腸癌 SW480 細胞形態(tài)變化，對照組和陰性對照組結(jié)腸癌 SW480 細胞融合成單層，細胞為梭形、多邊形或三角同時可見較多的處于分裂相的細胞，細胞密度大。TRPV6-RNAi 組結(jié)腸癌 SW4胞形態(tài)出現(xiàn)細胞皺縮、間隙增大、變圓等凋亡的表現(xiàn)，細胞密度比空白組和陰性組明顯減低，，且培養(yǎng)基中的懸浮死亡細胞較多（圖 1）。

圖 2 TRPV6-RNAi 轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌 SW480 細胞后 TRPV6 的表達;注：A：空白對照組，B：陰性對照組；C：TRPV6 RNAi 組。表 2 各組結(jié)腸癌 SW480 細胞中 TRPV6 的表達（ ±s ）。分組 空白對照組 陰性對照組 TRPV6-RNAi 組TRPV6 0.469±0.021 0.472±0.028 0.157±0.025*注：與空白對照組及陰性對照組進行比較*P＜0.05。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.35

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本文編號：2645249