【摘要】：研究背景近年來,胰腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢,然而總體生存率仍極為低下,往往發(fā)生局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后才能最終確診,5年生存率在6%左右,一般來說,50%的病人發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,30%的病人發(fā)現(xiàn)時處于局部晚期,另外僅僅20%的病人發(fā)現(xiàn)時才有手術(shù)機(jī)會,對于大多數(shù)病人,根治性手術(shù)已無法完成,最近一項(xiàng)研究顯示胰腺癌患者R0切除術(shù)后聯(lián)合化療,5年生存率15-30%,而且盡管術(shù)后聯(lián)合應(yīng)用吉西他濱或其他輔助化療,90%術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)。吉西他濱耐藥是目前胰腺癌治療的重點(diǎn)以及難點(diǎn),因此,闡明胰腺癌吉西他濱化療耐藥性的相關(guān)機(jī)制至關(guān)重要,目前已有多項(xiàng)研究提示胰腺癌化療耐藥涉及多種機(jī)制,包括異常基因表達(dá)、信號通路丟失、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及纖維組織增生等等,然而具體機(jī)制仍不明確。MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈小分子RNA,長約20-25個核苷酸,通過與多個靶基因的mRNA 3’非翻譯區(qū)不完全互補(bǔ)配對,配對成功后,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)。已經(jīng)證實(shí),miRNAs調(diào)控多種生理和病理過程,包括細(xì)胞生長、凋亡、細(xì)胞周期、分化、代謝和腫瘤發(fā)生。研究目的本研究旨在明確miR-183在胰腺癌發(fā)生發(fā)展及耐藥方面的機(jī)制。研究方法qRT-PCR方法檢測胰腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本以及三種胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1細(xì)胞,AsPC-1細(xì)胞,BxPC-3細(xì)胞)miR-183的表達(dá)水平,然后分析胰腺癌臨床病理因素與miR-183表達(dá)的關(guān)系。構(gòu)建過表達(dá)及沉默表達(dá)miR-183質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞,觀察miR-183對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及對吉西他濱化療敏感性的影響。裸鼠皮下移植腫瘤模型觀察miR-183在體內(nèi)對腫瘤生長的影響。生物學(xué)信息分析預(yù)測miR-183的靶基因,并應(yīng)用雙熒光檢測體系,qRT-PCR,western blotting方法明確miR-183的靶基因以及進(jìn)一步分析miR-183與靶基因在信號通路方面的作用機(jī)制。研究結(jié)果1.miR-183在癌組織較癌旁組織明顯升高,miR-183的表達(dá)差異與性別、年齡、部位、大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性,但與臨床分期,腫瘤分化程度有關(guān),我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)三種胰腺癌細(xì)胞系miR-183的表達(dá)水平較胰腺正常細(xì)胞株細(xì)胞均明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.首先我們成功建立過表達(dá)及沉默miR-183胰腺癌細(xì)胞,并應(yīng)用MTT及FCM方法檢測分別在轉(zhuǎn)染1d,2d,3d及4d細(xì)胞增殖數(shù)目,發(fā)現(xiàn)miR-183過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染組3天和4天后細(xì)胞增殖出現(xiàn)顯著上升,而細(xì)胞凋亡數(shù)目減少,并影響細(xì)胞周期G期,轉(zhuǎn)染miR-183 inhibitor至胰腺癌細(xì)胞系后,結(jié)果則相反,通過裸鼠皮下移植腫瘤模型,我們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)研究得出與體外研究類似的結(jié)論,miR-183起促癌作用。3.我們加入不同濃度吉西他濱(0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml)加入培養(yǎng)基中,通過使用MTT法檢測過表達(dá)miR-183及沉默miR-183對不同濃度下吉西他濱在PANC-1及BxPC-3細(xì)胞中的化學(xué)敏感性的影響,敲降miR-183表達(dá)能夠提高細(xì)胞對于吉西他濱的敏感性。利用miRNA數(shù)據(jù)庫TargetScan對miR-183可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)miR-183與BNIP3L的3’UTR區(qū)域有結(jié)合位點(diǎn),為驗(yàn)證BNIP3L是否為miR-183靶基因,我們構(gòu)建BNIP3L的3’UTR野生型表達(dá)載體PLuc-BNIP3L-3’-UTR以及Mut-BNIP3L-3’-UTR的突變載體;熒光素酶報告系統(tǒng),western blotting結(jié)果均顯示BNIP3L基因是miR-183的靶基因,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BNIP3L可逆轉(zhuǎn)miR-183對PI3K/Akt信號通路以及對胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和化療敏感性的影響。研究結(jié)論1.miR-183在胰腺癌異常表達(dá),且與腫瘤分期及分化有關(guān);2.體內(nèi)外研究表明miR-183起促癌作用并影響化療敏感性;3.miR-183通過靶基因BNIP3L介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路影響胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及化療敏感性;4.miR-183是胰腺癌一個新的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)結(jié) 果83 在胰腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)情況采用 RT-PCR 方法檢測 35 例胰腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本 miR結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-183 在癌組織較癌旁組織均明顯升高，差異有.01）（圖 1.1），當(dāng)我們進(jìn)一步對比在低分化、中分化以及高-183 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)低分化胰腺癌 miR-183 的表達(dá)水平最胰腺癌，高分化胰腺癌表達(dá)水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（83 的表達(dá)差異與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)(P>0.05) ，但與臨床分期有關(guān)（P <0.05）（表 1.1）。

12 2.179±0.3689 F=8.005 P<0.0111 3.298±0.342612 4.083±0.314383 在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)一步采用 RT-PCR 技術(shù)對 miR-183 在三種胰腺癌細(xì)胞系（C-1 細(xì)胞，BxPC-3 細(xì)胞）與胰腺正常細(xì)胞株 HPDE6C-7 細(xì)胞測，通過比值測定發(fā)現(xiàn)三種胰腺癌細(xì)胞系 miR-183 的表達(dá)水平 HPDE6C-7 細(xì)胞均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01），癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞miR-183表達(dá)最高，而中分化的胰腺癌細(xì)，高分化的胰腺癌細(xì)胞 BxPC-3 中表達(dá)較弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意iR-183 與胰腺癌的分化程度有關(guān)（P <0.01）（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9

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本文編號：2643514