【摘要】：近幾年來,癌癥的發(fā)病率和死亡率來呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,在早期檢測和治療中能夠快速、靈敏地檢測腫瘤標(biāo)記物具有重要意義。作為人體內(nèi)蛋白質(zhì)水解后的產(chǎn)物,小肽在氨基酸的消化、吸收等方面起到重要的作用。癌變過程發(fā)生后,癌細(xì)胞的新陳代謝與正常細(xì)胞會有很大的不同,癌細(xì)胞也會產(chǎn)生小肽類物質(zhì)。因此,通過檢測腫瘤相關(guān)小肽的含量水平,人們能夠能及時發(fā)現(xiàn)癌癥,從而達(dá)到疾病早期預(yù)警的目的。以雜交鏈反應(yīng)技術(shù)為代表的核酸循環(huán)放大方法由于具有反應(yīng)條件簡單溫和且信號放大效率高而備受關(guān)注。紙微流控以普通的色譜紙為基體材料,具有成本低廉、制作簡單和生物相容性好等優(yōu)點。因此,將有效的核酸循環(huán)光電信號放大體系引入到微流控紙芯片上,構(gòu)建高靈敏的生物傳感器檢測腫瘤相關(guān)小肽對于降低檢測成本、提高檢測靈敏度等具有重要意義。本論文分為以下幾部分:1.對核酸循環(huán)放大方法進(jìn)行初步研究,設(shè)計了一種簡單、快速地檢測腫瘤相關(guān)小肽mucins-1(MUC1)的方法,將適配體的特異性識別、氧化石墨烯的猝滅熒光效應(yīng)和核酸循環(huán)放大策略結(jié)合在了一個實驗體系內(nèi)。適配體不僅能夠與目標(biāo)小肽進(jìn)行特異性識別而且適配體上的引發(fā)序列能夠進(jìn)一步引發(fā)發(fā)卡探針之間的雜交鏈反應(yīng)。通過氧化石墨烯的吸附、富集作用,雜交鏈反應(yīng)的反應(yīng)時間大大縮短,減少了分析檢測時間。氧化石墨烯對熒光的猝滅作用使得背景信號大大降低,從而極大地提高了檢測的靈敏度。2.將高效率的核酸循環(huán)放大體系與低成本的紙微流控相結(jié)合,設(shè)計并構(gòu)建了一種靈敏檢測腫瘤相關(guān)小肽MUC1的紙基傳感器。目標(biāo)小肽的存在會使得引發(fā)序列與適配體分離,從而兩個發(fā)卡探針之間的雜交鏈反應(yīng)在傳感表面形成長鏈DNA,成功地將目標(biāo)物的檢測轉(zhuǎn)化為放大后的長鏈DNA的定量。大量電化學(xué)發(fā)光探針嵌入到長鏈DNA后,電化學(xué)發(fā)光信號就間接地與目標(biāo)小肽的含量建立定量關(guān)系,從而實現(xiàn)腫瘤相關(guān)小肽的靈敏檢測。3.將紙微流控與DNA鏈置換為基礎(chǔ)的核酸循環(huán)放大技術(shù)相結(jié)合,成功地把金屬離子電化學(xué)標(biāo)記和釕的配合物電子線引入到檢測體系中來,設(shè)計并構(gòu)建了一種能同時檢測兩種目標(biāo)物的電化學(xué)適配體傳感。目標(biāo)物的特異性識別是基于目標(biāo)物與適配體之間的親和力大于適配體與其互補序列之間的親和力這一實驗事實為基礎(chǔ)實現(xiàn)的;信號的轉(zhuǎn)換與放大通過金/牛血清白蛋納米球負(fù)載大量的金屬離子電化學(xué)標(biāo)記和兩種金屬離子各自的特異性電化學(xué)檢測峰來實現(xiàn);檢測體系的靈敏度得益于將釕的配合物引入檢測體系形成電子線從而減少了DNA骨架對電子傳遞的阻力。
【圖文】：

核酸循環(huán)光電信號放大的紙微流控檢測腫瘤相關(guān)小肽點而被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域[25]。RCA 的機理如圖 1.1 所示。首先，含NA 模板（Circular Template）在連接酶（Ligase）的作用下與連接模板）相結(jié)合。其中，連接模板是一個能將環(huán)狀 DNA 模板間隙兩側(cè)連接料（脫氧核苷三磷 dNTPs 或者三磷酸核苷 NTPs 的混合溶液）存在合酶或者 RNA 聚合酶的連接反應(yīng)使得 RCA 得以進(jìn)行，從而形成含有核酸產(chǎn)物。RCA 最終得到的長鏈核苷酸產(chǎn)物用探針標(biāo)記后可以進(jìn)一析物，如 DNA、RNA、小分子、蛋白質(zhì)甚至是細(xì)胞。

濟(jì)南大學(xué)碩士學(xué)位論文FIP 和 F3 相同的引物會引發(fā)合成步驟，從而生成一個啞鈴形的 DNA。合成步驟生成的啞鈴形DNA會經(jīng)過自引物DNA合成快速轉(zhuǎn)換成一個莖環(huán)DNA并作為 LAMP反應(yīng)的起始原料。第二個過程是循環(huán)放大步驟。首先，F(xiàn)IP 與上述步驟所得莖環(huán) DNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分發(fā)生雜交反應(yīng)，進(jìn)而通過鏈置換反應(yīng)來實現(xiàn) LAMP 循環(huán)。這個過程會產(chǎn)生一個帶有另一個環(huán)的中空莖環(huán)DNA。自引物鏈置換介導(dǎo)的 DNA合成會產(chǎn)生一個間隙修復(fù)莖環(huán) DNA和一個長的 DNA 序列，這個長序列與原始莖環(huán) DNA 堿基互補。這些產(chǎn)物為 BIP 的識別和雜交進(jìn)而引發(fā)新的合成過程提供了模板，，而新的合成過程中的一部分就是在后續(xù)循環(huán)中鏈的延長和循環(huán)步驟。LAMP 最終得到的產(chǎn)物是一個有不同莖長度和菜花狀結(jié)構(gòu)的復(fù)合莖環(huán) DNA。與傳統(tǒng)的 PCR 技術(shù)相比，LAMP 所實現(xiàn)的指數(shù)擴增在提高檢測的靈敏度和擴增效率方面具有更大的優(yōu)勢。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3;R730.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊紹明;查文玲;李紅;孫清;劉斌;鄭龍珍;;半胱氨酸封閉劑為電化學(xué)探針的非標(biāo)記型核酸適配體傳感器[J];應(yīng)用化學(xué);2013年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王永紅;基于納米材料信號增強的電化學(xué)生物傳感器研究[D];湖南大學(xué);2012年

本文編號：2638516