【摘要】：近幾年來(lái),癌癥的發(fā)病率和死亡率來(lái)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),在早期檢測(cè)和治療中能夠快速、靈敏地檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物具有重要意義。作為人體內(nèi)蛋白質(zhì)水解后的產(chǎn)物,小肽在氨基酸的消化、吸收等方面起到重要的作用。癌變過(guò)程發(fā)生后,癌細(xì)胞的新陳代謝與正常細(xì)胞會(huì)有很大的不同,癌細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生小肽類物質(zhì)。因此,通過(guò)檢測(cè)腫瘤相關(guān)小肽的含量水平,人們能夠能及時(shí)發(fā)現(xiàn)癌癥,從而達(dá)到疾病早期預(yù)警的目的。以雜交鏈反應(yīng)技術(shù)為代表的核酸循環(huán)放大方法由于具有反應(yīng)條件簡(jiǎn)單溫和且信號(hào)放大效率高而備受關(guān)注。紙微流控以普通的色譜紙為基體材料,具有成本低廉、制作簡(jiǎn)單和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。因此,將有效的核酸循環(huán)光電信號(hào)放大體系引入到微流控紙芯片上,構(gòu)建高靈敏的生物傳感器檢測(cè)腫瘤相關(guān)小肽對(duì)于降低檢測(cè)成本、提高檢測(cè)靈敏度等具有重要意義。本論文分為以下幾部分:1.對(duì)核酸循環(huán)放大方法進(jìn)行初步研究,設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)腫瘤相關(guān)小肽mucins-1(MUC1)的方法,將適配體的特異性識(shí)別、氧化石墨烯的猝滅熒光效應(yīng)和核酸循環(huán)放大策略結(jié)合在了一個(gè)實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)。適配體不僅能夠與目標(biāo)小肽進(jìn)行特異性識(shí)別而且適配體上的引發(fā)序列能夠進(jìn)一步引發(fā)發(fā)卡探針之間的雜交鏈反應(yīng)。通過(guò)氧化石墨烯的吸附、富集作用,雜交鏈反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間大大縮短,減少了分析檢測(cè)時(shí)間。氧化石墨烯對(duì)熒光的猝滅作用使得背景信號(hào)大大降低,從而極大地提高了檢測(cè)的靈敏度。2.將高效率的核酸循環(huán)放大體系與低成本的紙微流控相結(jié)合,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種靈敏檢測(cè)腫瘤相關(guān)小肽MUC1的紙基傳感器。目標(biāo)小肽的存在會(huì)使得引發(fā)序列與適配體分離,從而兩個(gè)發(fā)卡探針之間的雜交鏈反應(yīng)在傳感表面形成長(zhǎng)鏈DNA,成功地將目標(biāo)物的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為放大后的長(zhǎng)鏈DNA的定量。大量電化學(xué)發(fā)光探針嵌入到長(zhǎng)鏈DNA后,電化學(xué)發(fā)光信號(hào)就間接地與目標(biāo)小肽的含量建立定量關(guān)系,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)小肽的靈敏檢測(cè)。3.將紙微流控與DNA鏈置換為基礎(chǔ)的核酸循環(huán)放大技術(shù)相結(jié)合,成功地把金屬離子電化學(xué)標(biāo)記和釕的配合物電子線引入到檢測(cè)體系中來(lái),設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種能同時(shí)檢測(cè)兩種目標(biāo)物的電化學(xué)適配體傳感。目標(biāo)物的特異性識(shí)別是基于目標(biāo)物與適配體之間的親和力大于適配體與其互補(bǔ)序列之間的親和力這一實(shí)驗(yàn)事實(shí)為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的;信號(hào)的轉(zhuǎn)換與放大通過(guò)金/牛血清白蛋納米球負(fù)載大量的金屬離子電化學(xué)標(biāo)記和兩種金屬離子各自的特異性電化學(xué)檢測(cè)峰來(lái)實(shí)現(xiàn);檢測(cè)體系的靈敏度得益于將釕的配合物引入檢測(cè)體系形成電子線從而減少了DNA骨架對(duì)電子傳遞的阻力。
【圖文】：

核酸循環(huán)光電信號(hào)放大的紙微流控檢測(cè)腫瘤相關(guān)小肽點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[25]。RCA 的機(jī)理如圖 1.1 所示。首先，含NA 模板（Circular Template）在連接酶（Ligase）的作用下與連接模板）相結(jié)合。其中，連接模板是一個(gè)能將環(huán)狀 DNA 模板間隙兩側(cè)連接料（脫氧核苷三磷 dNTPs 或者三磷酸核苷 NTPs 的混合溶液）存在合酶或者 RNA 聚合酶的連接反應(yīng)使得 RCA 得以進(jìn)行，從而形成含有核酸產(chǎn)物。RCA 最終得到的長(zhǎng)鏈核苷酸產(chǎn)物用探針標(biāo)記后可以進(jìn)一析物，如 DNA、RNA、小分子、蛋白質(zhì)甚至是細(xì)胞。

濟(jì)南大學(xué)碩士學(xué)位論文FIP 和 F3 相同的引物會(huì)引發(fā)合成步驟，從而生成一個(gè)啞鈴形的 DNA。合成步驟生成的啞鈴形DNA會(huì)經(jīng)過(guò)自引物DNA合成快速轉(zhuǎn)換成一個(gè)莖環(huán)DNA并作為 LAMP反應(yīng)的起始原料。第二個(gè)過(guò)程是循環(huán)放大步驟。首先，F(xiàn)IP 與上述步驟所得莖環(huán) DNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分發(fā)生雜交反應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)鏈置換反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn) LAMP 循環(huán)。這個(gè)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一個(gè)帶有另一個(gè)環(huán)的中空莖環(huán)DNA。自引物鏈置換介導(dǎo)的 DNA合成會(huì)產(chǎn)生一個(gè)間隙修復(fù)莖環(huán) DNA和一個(gè)長(zhǎng)的 DNA 序列，這個(gè)長(zhǎng)序列與原始莖環(huán) DNA 堿基互補(bǔ)。這些產(chǎn)物為 BIP 的識(shí)別和雜交進(jìn)而引發(fā)新的合成過(guò)程提供了模板，，而新的合成過(guò)程中的一部分就是在后續(xù)循環(huán)中鏈的延長(zhǎng)和循環(huán)步驟。LAMP 最終得到的產(chǎn)物是一個(gè)有不同莖長(zhǎng)度和菜花狀結(jié)構(gòu)的復(fù)合莖環(huán) DNA。與傳統(tǒng)的 PCR 技術(shù)相比，LAMP 所實(shí)現(xiàn)的指數(shù)擴(kuò)增在提高檢測(cè)的靈敏度和擴(kuò)增效率方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657.3;R730.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊紹明;查文玲;李紅;孫清;劉斌;鄭龍珍;;半胱氨酸封閉劑為電化學(xué)探針的非標(biāo)記型核酸適配體傳感器[J];應(yīng)用化學(xué);2013年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王永紅;基于納米材料信號(hào)增強(qiáng)的電化學(xué)生物傳感器研究[D];湖南大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2638516