【摘要】：第一部分乏氧微環(huán)境對(duì)乳腺癌腫瘤再生細(xì)胞增殖的影響目的:腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是一群具自我更新,多能分化及啟動(dòng)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)潛能等干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞,也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療抵抗和治療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。乏氧是調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵微環(huán)境因子,同時(shí)也可以使腫瘤干細(xì)胞富集,但是氧是否可以直接促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的增殖并不清楚。本部分研究基于三維軟纖維蛋白基質(zhì)膠(3D fibrin)分離篩選出乳腺癌腫瘤干細(xì)胞(定義為腫瘤再生細(xì)胞,TRCs),利用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑構(gòu)建腫瘤乏氧模型,探討體內(nèi)外乏氧對(duì)腫瘤干細(xì)胞增殖的影響。方法:(1)使用蘋果酸舒尼替尼構(gòu)建腫瘤乏氧模型;觀察兩組腫瘤體積的大小,免疫熒光染色檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)的乏氧區(qū)域及血管分布情況;(2)使用流式細(xì)胞儀從乳腺癌腫瘤組織中分選出ALDH高表達(dá)及低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞,并將其接種至三維軟纖維蛋白基質(zhì)膠中,觀察比較ALDH~+和ALDH~-細(xì)胞形成的克隆數(shù)目。(3)Real time PCR檢測(cè)兩組腫瘤組織中干性基因的表達(dá)(ALDH1A1、OCT4、KLF4、SOX2),Western blot檢測(cè)ALDH1A1、PCK2的蛋白表達(dá)水平。(4)利用BrdU免疫熒光染色觀察兩組腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞的增殖情況。(5)將MCF-7、BT474及人原代乳腺癌TRCs分別置于常氧(21%O_2)和乏氧(1%O_2)的條件下培養(yǎng)6天,統(tǒng)計(jì)克隆體積及克隆數(shù)量;(6)利用CoCl_2模擬乏氧,觀察不同濃度CoCl_2對(duì)MCF-7 TRCs克隆體積及數(shù)量的影響;(7)利用BrdU染色,觀察兩組細(xì)胞的增殖,同時(shí)利用PI和AnnexinV雙染檢測(cè)其凋亡;(8)采用Real time PCR檢測(cè)干性基因在兩組細(xì)胞中的表達(dá)差異。(9)將不同數(shù)量的常氧與乏氧MCF-7 TRCs接種于NOD-SCID小鼠乳腺墊下,觀察兩組的成瘤率及成瘤時(shí)間的差異。結(jié)果:(1)舒尼替尼處理組腫瘤體積明顯縮小、乏氧區(qū)域明顯增多,CD31染色顯示血管分布減少。(2)ALDH~+腫瘤細(xì)胞形成的克隆數(shù)目顯著高于ALDH~-的腫瘤細(xì)胞;(3)舒尼替尼處理組干性基因表達(dá)水平明顯升高,ALDH蛋白表達(dá)上調(diào),PCK2蛋白表達(dá)下調(diào)。(4)舒尼替尼處理組乏氧區(qū)域內(nèi)ALDH及BrdU表達(dá)升高。(5)在乏氧情況下,MCF-7、BT474及人原代乳腺TRCs克隆體積明顯增大。(6)在一定的濃度范圍內(nèi),隨著CoCl_2濃度的增加,MCF-7 TRCs克隆體積逐漸增大。(7)與常氧對(duì)照相比,乏氧組MCF-7 TRCs顯著增加DNA合成(S期)。(8)乏氧組腫瘤干性基因(CD133、OCT4、KLF4、ALDH、SOX2)的表達(dá)明顯高于常氧組。(9)乏氧組的成瘤能力顯著高于常氧組。結(jié)論:乏氧微環(huán)境可以明顯促進(jìn)乳腺癌腫瘤再生細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其腫瘤干細(xì)胞表型的表達(dá),同時(shí)明顯增強(qiáng)乳腺癌腫瘤再生細(xì)胞在體內(nèi)的致瘤性。第二部分乏氧微環(huán)境介導(dǎo)的TCA循環(huán)重塑與ROS生成的機(jī)制研究目的:通過(guò)分析TCA循環(huán)中間代謝產(chǎn)物的變化,探索乏氧介導(dǎo)ROS升高的機(jī)制;進(jìn)一步探究ROS促進(jìn)乳腺癌腫瘤再生細(xì)胞增殖的機(jī)制。方法:(1)在常氧和乏氧情況下,使用ROS熒光探針檢測(cè)MCF-7以及人原代乳腺癌腫瘤再生細(xì)胞(TRCs)中的ROS水平,檢測(cè)乏氧情況下經(jīng)ROS清除劑NAC處理后MCF-7 TRCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平;(2)乏氧情況下,經(jīng)不同濃度NAC和有氧情況下不同濃度H2O2處理后,觀察MCF-7 TRCs的克隆體積;(3)乏氧情況下,使用ROS熒光探針檢測(cè)MCF-7及MCF-7 TRCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平,同時(shí)在2D培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞中,加入不同濃度NAC,計(jì)數(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的增殖狀況;(4)Western blot檢測(cè)MCF-7及人原代乳腺癌TRCs中NF-κB和Akt的表達(dá)及NAC處理后NF-κB和Akt磷酸化水平的變化;(5)MCF-7 TRCs經(jīng)NF-κB和Akt抑制劑處理后,Western blot檢測(cè)NF-κB和Akt磷酸化水平,并觀察MCF-7 TRCs的克隆體積的變化;(6)13C標(biāo)記的葡萄糖處理MCF-7 TRCs后LC/MS/MS檢測(cè)TCA循環(huán)的代謝變化;(7)Western blot檢測(cè)TCA循環(huán)限速酶CS、IDH3G、OGDH的表達(dá);(8)使用si RNA沉默MDH2、IDH3G后,觀察MCF-7 TRCs克隆體積變化,同時(shí),使用ROS熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;(9)使用si RNA沉默IDH3G,同時(shí)加入不同濃度的H2O2,觀察MCF-7 TRCs克隆體積變化;(10)LC/MS/MS檢測(cè)TCA循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及蘋果酸的含量;(11)使用不同濃度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富馬酸二甲酯(DMF)和L-蘋果酸處理常氧MCF-7 TRCs后,ROS熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;(12)常氧乏氧情況下,使用LC/MS/MS檢測(cè)MCF-7 TRCs細(xì)胞內(nèi)GSF含量;(13)在常氧與乏氧情況下,使用NADPH及GSH試劑盒檢測(cè)MCF-7 TRCs胞內(nèi)NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比值;(14)GSH-MEE處理乏氧的MCF-7 TRCs后,使用NADPH及ROS熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP+及ROS水平;(15)加入不同濃度GSH-MEE處理MCF-7 TRCs后,觀察克隆體積變化;(16)使用si RNA沉默IDH3G后,檢測(cè)GSF的含量變化及細(xì)胞內(nèi)NADPH/DNAP+的比值。結(jié)果:(1)乏氧情況下,MCF-7、人原代乳腺癌TRCs中ROS含量升高,經(jīng)NAC處理后ROS含量下降,且呈濃度梯度依賴;(2)乏氧情況下加入NAC清除ROS后,有效阻礙了TRCs的生長(zhǎng);反之,常氧條件下加入低濃度的H2O2可促進(jìn)MCF-7 TRCs的生長(zhǎng);(3)常規(guī)2D培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞在乏氧條件下具有更高的ROS水平,NAC處理降低ROS水平后,乏氧所致的生長(zhǎng)遲緩得到明顯恢復(fù)。(4)乏氧導(dǎo)致MCF-7 TRCs中NF-κB和Akt磷酸化水平升高,加入NAC后磷酸化水平受抑制;(5)使用NF-κB和Akt抑制劑后,MCF-7 TRCs NF-κB和Akt磷酸化減弱,增殖明顯被抑制;(6)13C葡萄糖同位素示蹤試驗(yàn)顯示乏氧時(shí)MCF-7 TRCs的TCA循環(huán)明顯減慢;(7)乏氧時(shí),MCF-7 TRCs中TCA循環(huán)的限速酶CS、IDH3G、OGDH的表達(dá)均下調(diào);(8)沉默MDH2后MCF-7 TRCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高且克隆體積增大;而沉默IDH3G后細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低,克隆體積明顯縮小;(9)H2O2可以逆轉(zhuǎn)沉默IDH3G后克隆體積的縮小;(10)乏氧時(shí),TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及蘋果酸均升高,且延胡索酸及蘋果酸升高尤為明顯;(11)不同濃度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富馬酸二甲酯(DMF)和L-蘋果酸處理常氧MCF-7 TRCs后,僅DMF使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高且與濃度呈正比;(12)與常氧相比,乏氧MCF-7 TRCs細(xì)胞內(nèi)GSF比例升高且胞內(nèi)NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比例均降低。(13)GSH-MEE處理乏氧MCF-7 TRCs后,細(xì)胞內(nèi)NADPH/DNAP+升高,ROS水平降低,阻礙了乏氧對(duì)于TRC生長(zhǎng)的促進(jìn)作用;(14)琥珀酰化谷胱甘肽的升高以及NADPH/NADP+的降低可通過(guò)IDH3G補(bǔ)救。結(jié)論:乏氧導(dǎo)致TCA循環(huán)流動(dòng)減慢,致使中間代謝產(chǎn)物延胡索酸堆積,而延胡索酸積累則導(dǎo)致琥珀酰化谷胱甘肽的形成,在GSF的形成過(guò)程中消耗了GSH及NADPH最終導(dǎo)致MCF-7 TRCs內(nèi)的ROS水平增加。同時(shí),ROS水平升高激活信號(hào)分子NF-κB和Akt,促進(jìn)人乳腺癌TRC的生長(zhǎng)。第三部分HIF-1α介導(dǎo)的PCK2下調(diào)在乳腺癌TRCs TCA循環(huán)重塑中的作用目的:以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為模型,探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK2)的下調(diào)表達(dá)對(duì)腫瘤再生細(xì)胞(TRCs)TCA循環(huán)中間代謝物(草酰乙酸、延胡索酸)的影響以及導(dǎo)致乏氧乳腺癌TRC中的延胡索酸積累的原因。同時(shí)進(jìn)一步探究乏氧情況下PCK2下調(diào)表達(dá)的分子機(jī)制.方法:(1)乏氧情況下,Western blot檢測(cè)MCF-7 TRCs中PCK2的表達(dá)情況;(2)使用四環(huán)素誘導(dǎo)的PCK2過(guò)表達(dá)系統(tǒng),檢測(cè)PCK2高表達(dá)后乳腺癌TRCs中延胡索酸,琥珀�；入赘孰�(GSF)和ROS水平以及NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值;(3)利用OAA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)有氧、乏氧情況下及PCK2高表達(dá)后OAA含量的變化;(4)利用同位素標(biāo)記的13C葡萄糖處理MCF-7 TRCs后,使用LC/MS/MS檢測(cè)PCK2過(guò)表達(dá)后TCA循環(huán)的流動(dòng)情況;(5)Western blot檢測(cè)MCF-7 TRCs中HIF的表達(dá),同時(shí)沉默或過(guò)表達(dá)HIF-1α后檢測(cè)PCK2蛋白的表達(dá)水平;(6)利用同位素標(biāo)記的13C檢測(cè)HIF-1α沉默后TCA循環(huán)的流動(dòng)情況;(7)UCSC基因組瀏覽器和JASPAR分析PCK2的啟動(dòng)子區(qū)域是否存在HIF-1α結(jié)合位點(diǎn),并用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證;(8)利用PCK2啟動(dòng)子螢光素酶測(cè)定熒光素酶的表達(dá),以確定HIF-1α與PCK2之間的調(diào)控關(guān)系;(9)使用富馬酸二甲酯(DMF)處理缺氧的MCF-7 TRCs,Western blot檢測(cè)HIF-1α及PCK2的表達(dá);結(jié)果:(1)乏氧時(shí),MCF-7 TRCs的PCK2表達(dá)下調(diào);(2)過(guò)表達(dá)PCK2后,延胡索酸、GSF和ROS水平降低,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值增加;(3)乏氧時(shí),MCF-7 TRCs細(xì)胞內(nèi)OAA含量升高,PCK2過(guò)表達(dá)后OAA含量下降;(4)乏氧時(shí),PCK2過(guò)表達(dá)后,TRCs的TCA循環(huán)加速,m+2和m+4形式的檸檬酸,α-酮戊二酸,延胡索酸和蘋果酸比例升高;(5)常氧和乏氧乳腺癌TRCs均表達(dá)HIF-2α,而HIF-1α僅在乏氧的TRCs中顯著上調(diào)。si RNAs沉默HIF-1α?xí)r,PCK2表達(dá)上調(diào),過(guò)表達(dá)HIF-1α后,PCK2表達(dá)下調(diào);(6)HIF-1α沉默后促進(jìn)TCA循環(huán)的流動(dòng);(7)UCSC基因組瀏覽器和JASPAR分析揭示在PCK2的啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn),并且Chip-PCR測(cè)定表明HIF-1α可以直接結(jié)合到PCK2的啟動(dòng)子區(qū);(8)PCK2啟動(dòng)子螢光素酶測(cè)定顯示,HIF-1α敲低增加螢光素酶的活性,HIF-1α過(guò)表達(dá)降低螢光素酶活性;(9)富馬酸二甲酯(DMF)處理乏氧乳腺癌TRCs后,HIF-1α的表達(dá)增強(qiáng),且PCK2表達(dá)降低。結(jié)論:PCK2下調(diào)導(dǎo)致的OAA積累阻礙了TCA循環(huán)的碳流動(dòng)并導(dǎo)致乏氧乳腺癌TRCs中的延胡索酸積累;缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α負(fù)調(diào)節(jié)PCK2表達(dá),延胡索酸積累進(jìn)一步加強(qiáng)了這種反饋。
【圖文】：

尼治療構(gòu)建 MCF-7 瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境替尼是一種 VEGF 受體酪氨酸激酶抑制劑，在臨床中用作抗血腫瘤內(nèi)缺氧[47]。為了在體內(nèi)探究乏氧是否可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞MCF-7 TRCs 注射到裸鼠皮下，并且當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到 50-100mm3時(shí)60mg/kg/天）治療小鼠。35 天后，將小鼠處死，應(yīng)用乏氧probe）及 CD31 熒光染色評(píng)價(jià)腫瘤組織內(nèi)乏氧及血管分布情況替尼處理后，小鼠腫瘤生長(zhǎng)變緩，腫瘤體積較對(duì)照組明顯縮探針 Hypoxyprobe 染色顯示舒尼替尼治療組小鼠的腫瘤組織中氧區(qū)域（圖 1B）；與已有的研究結(jié)果一致，舒尼替尼處理后腫明顯減少（圖 1C），以上結(jié)果說(shuō)明舒尼替尼治療后可以造成腫境。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文800 μm); C. Vascular density was stained by CD31 antibody. (Scale bar, 0.5 cm).2.2 乏氧增強(qiáng)體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞的干性既往研究證實(shí)，乏氧可以通過(guò)上調(diào)諸如 OCT4、SOX2 和 NANOG 等干性基因的表達(dá)，這些基因在維持干細(xì)胞自我更新或調(diào)節(jié)細(xì)胞自我分化中起到重要作用。為了檢測(cè)體內(nèi)乏氧能否增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞樣表型，，我們用 Real-time PCR,Western blot 檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)干性相關(guān)基因，結(jié)果顯示舒尼替尼治療組干性基因Sox2，Oct3/4 和 KLF4 表達(dá)升高（圖 2A）。乙醛脫氫酶 1（ALDH1）通常用于標(biāo)記乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞[48]，因此我們通過(guò) Real-time PCR, Westernblot 檢測(cè)了ALDH1 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼治療組 ALDH1 在基因和蛋白水平上表達(dá)均顯著升高（圖 2B）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9

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