【摘要】：背景和目的多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是繼非霍奇金淋巴瘤之后的第二種常見血液系統(tǒng)惡性疾病,在惡性血液疾病中占13%。目前尚無(wú)法治愈。硼替佐米(bortezomib,BTZ)是第一代蛋白酶體抑制劑,其對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的療效顯著,以PD為主的方案為國(guó)內(nèi)外指南推薦的一線治療方案,且硼替佐米(萬(wàn)珂)于2017年9月進(jìn)入我國(guó)國(guó)家醫(yī)保目錄,使得更多的多發(fā)性骨髓瘤中國(guó)中國(guó)患者可以用上此藥。不過(guò),為了進(jìn)一步提高療效,在PD方案基礎(chǔ)上加用輔助藥物依然是血液科醫(yī)師治療MM時(shí)面臨的挑戰(zhàn)。重組變構(gòu)人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(recombinant mutant of human TRAIL,rmh TRAIL)是一種重組蛋白類抗腫瘤藥物,由我國(guó)北京沙東生物公司研制并且正在進(jìn)行rmh TRAIL為主的方案治療難治復(fù)發(fā)多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗(yàn)。rmh TRAIL聯(lián)合硼替佐米可能成為更適合中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤患者的方案。表觀遺傳學(xué)引入對(duì)疾病的分層、治療和用藥等有重大的指導(dǎo)作用。微小RNA可以在轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),蛋白的表達(dá)等諸多方面影響生命活動(dòng)。mi R-17-5p和mi R-886-5p為調(diào)節(jié)腫瘤表達(dá)兩種重要微小RNA,在乳腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中,已經(jīng)被廣泛研究,單尚無(wú)其和多發(fā)性骨髓瘤的相關(guān)報(bào)道。由上背景,本課題旨在探索以下問(wèn)題。1.探索rmh TRAIL單藥對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株增殖抑制的影響。2.測(cè)量rmh TRAIL藥物處理后多發(fā)性骨髓瘤中mi R-17-5p和mi R-886-5p的變化。3.探索BTZ單藥及rmh TRAIL聯(lián)合BTZ對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株增殖抑制的影響。4.測(cè)量BTZ單藥及rmh TRAIL聯(lián)合BTZ處理后多發(fā)性骨髓瘤中mi R-17-5p和mi R-886-5p的變化。方法1.培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266B1和NCI-H929。使用CCK-8法測(cè)量rmh TRAIL(0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml)對(duì)其增殖抑制的影響,并采用流式細(xì)胞術(shù)的方法測(cè)量細(xì)胞凋亡,MM細(xì)胞分別使用藥物處理后,提取其中的mi R-886-5p和mi R-17-5p,比較含量的差異,通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是否和藥物作用呈現(xiàn)相關(guān)性。2.培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266B1和NCI-H929。使用CCK-8法測(cè)量rmh TRAIL(20000ng/ml)聯(lián)合不同濃度的BTZ(10/20/40/80/160n M)對(duì)其增殖抑制的影響,并采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡率。MM細(xì)胞分別使用藥物處理后,提取其中的mi R-886-5p和mi R-17-5p,利用PCR的方法比較含量的差異,通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是否和藥物作用呈現(xiàn)相關(guān)性。結(jié)果1 CCK-8法檢測(cè)rmh TRAIL對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制的影響rmh TRAIL對(duì)多發(fā)性骨髓瘤NCI-H929細(xì)胞株具有增殖抑制性。不同劑量rmh TRAIL(0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml)RMHTRAIL作用于NCIH929細(xì)胞,24h增殖抑制率的變化趨勢(shì)為,(-1.34±0.45)%增加到(35.66±0.39)%,48h增殖抑制率從(6.53±0.33)%增加到(52.23±0.96)%,72h增殖抑制率從(19.73±0.84)%增加到(70.04±0.56)%,呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性(P0.05)。RMHTRAIL處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞24h、48h、72h后的IC50值分別為(63579.532±4.803)ng/ml,(15580.413±4.193)ng/ml,(5181.069±3.714)ng/ml。與NCI-H929細(xì)胞形成鮮明對(duì)比的是,不同劑量的rmh TRAIL(0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml)rmh TRAIL作用于U266B1細(xì)胞,24h增殖抑制率的變化趨勢(shì)為,(-5.62±0.24)%增加到(4.66±0.14)%,48h增殖抑制率從(2.23±0.32)%增加到(7.84±0.36)%,72h增殖抑制率從(1.73±0.32)%增加到(9.04±1.26)%,不呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和濃度依賴性(P0.05)。2 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)rmh TRAIL處理多發(fā)性骨髓瘤后的細(xì)胞凋亡率取rmh TRAIL的IC50濃度作用于作用U266B1和NCI-H929細(xì)胞48h后,U266B1細(xì)胞凋亡率從(6.61±0.67)%增加到(7.06±0.28)%,而NCI-H929細(xì)胞的凋亡率從(5.59±0.03)%增加到(27.13±1.35)%。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,發(fā)現(xiàn)rmh TRAIL對(duì)NCI-H929的增殖抑制有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而對(duì)于U266B1細(xì)胞則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3 rmh TRAIL對(duì)MM細(xì)胞中mi R-17-5p和mi R-886-5p的影響rmh TRAIL處理U266B1細(xì)胞后,使用Trizol試劑提取其中的micro RNAs并行反轉(zhuǎn)錄,PCR,測(cè)量mi R-17-5p和mi R-886-5p在細(xì)胞中的含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rmh TRAIL處理NCI-H929細(xì)胞后,mi R-17-5p和mi R-886-5p含量變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩者的含量均明顯降低。4 CCK-8法檢測(cè)BTZ及rmh TRAIL聯(lián)合BTZ對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制的影響rmh TRAIL對(duì)多發(fā)性骨髓瘤NCI-H929細(xì)胞株具有增殖抑制性。不同劑量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于NCI-H929細(xì)胞,24h增殖抑制率的變化趨勢(shì)為,(6.79±0.79)%增加到(42.02±0.56)%,48h增殖抑制率從(12.14±0.85)%增加到(69.99±0.73)%,72h增殖抑制率從(14.10±0.51)%增加到(81.70±1.28)%,呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性(P0.05)。BTZ處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞24h、48h、72h后的IC50值分別為(211.95±1.87)ng/ml,(73.78±1.87)ng/ml,(56.22±1.75)ng/ml。不同劑量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于U266B1細(xì)胞,24h增殖抑制率的變化趨勢(shì)為,(6.29±0.31)%增加到(9.25±0.59)%,48h增殖抑制率從(7.54±0.21)%增加到(56.97±0.85)%,72h增殖抑制率從(12.71±0.22)%增加到(70.23±0.76)%,不呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和濃度依賴性(P0.05)。BTZ處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266B1種系24h、48h、72h后的IC50值分別為(216.13±2.33)ng/ml,(121.68±2.09)ng/ml,(72.03±1.86)ng/ml。rmh TRAIL聯(lián)合BTZ得到了和BTZ單藥相似的結(jié)果。不同劑量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于U266B1細(xì)胞,24h增殖抑制率的變化趨勢(shì)為,(2.61±0.90)%增加到(54.26±0.72)%,48h增殖抑制率從(8.73±0.65)%增加到(53.95±1.46)%,72h增殖抑制率從(11.63±0.85)%增加到(72.88±1.24)%,呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性(P0.05)。rmh TRAIL聯(lián)合不同劑量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于NCI-H929細(xì)胞,24h增殖抑制率的變化趨勢(shì)為,(55.91±0.48)%增加到(92.56±0.54)%,48h增殖抑制率從(60.25±1.30)%增加到(92.58±1.52)%,72h增殖抑制率從(72.52±0.81)%增加到(93.23±1.09)%,不呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和濃度依賴性(P0.05)。5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)rmh TRAIL處理多發(fā)性骨髓瘤后的細(xì)胞凋亡率取BTZ的IC50濃度作用于作用U266B1和NCI-H929細(xì)胞48h后,U266B1細(xì)胞凋亡率從(5.89±0.18)%增加到(26.43±0.86)%,雙藥聯(lián)合的增殖抑制率為(26.95±1.87)。而NCI-H929細(xì)胞的凋亡率從8.78±0.99)%增加到(24.32±0.53)%,雙藥聯(lián)合的增殖抑制率達(dá)到(30.35±1.35)。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,發(fā)現(xiàn)BTZ組及RMHTRAIL聯(lián)合BTZ組對(duì)NCIH929和NCI-H929細(xì)胞的增殖抑制有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。6 BTZ及rmh TRAIL聯(lián)合BTZ對(duì)MM細(xì)胞中mi R-17-5p和mi R-886-5p的影響B(tài)TZ單藥及RMHTRAIL聯(lián)合BTZ處理U266B1細(xì)胞后,mi R-17-5p和mi R-886-5p在細(xì)胞中的含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BTZ單藥及RMHTRAIL聯(lián)合BTZ處理NCI-H929細(xì)胞后,mi R-17-5p和mi R-886-5p含量變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩者的含量均明顯降低。小結(jié)1.rmh TRAIL對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株NCI-H929具有增長(zhǎng)抑制,對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266B1無(wú)增殖抑制作用。2.rmh TRAIL處理NCI-H929細(xì)胞,其中mi R-17-5p和mi R-886-5p的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而對(duì)于U266B1細(xì)胞則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.BTZ對(duì)MM細(xì)胞U266B1和NCI-H929均有較明顯的抑制作用。BTZ聯(lián)合rmh TRAIL對(duì)NCI-H929具有顯著的抑制作用,且雙藥表現(xiàn)出協(xié)同作用,對(duì)于U266B1細(xì)胞同樣具有增殖抑制作用,但是兩藥無(wú)協(xié)同作用。4.rmh TRAIL聯(lián)合BTZ處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929和U266B1,其中mi R-17-5p和mi R-886-5p的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【圖文】：

圖 2.4 rmhTRAIL 處理 U266B1 細(xì)胞和 NCI-H929 對(duì)其凋亡率的影響：A1：rmhTRAIL 處理U266B1 細(xì)胞空白對(duì)照；A2：rmhTRAIL 處理 U266B1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組；B1：rmhTRAIL 處理 NCI-H929 細(xì)胞空白對(duì)照；B2：rmhTRAIL 處理 NCI-H929 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組。rmhTRAIL 藥物濃度 20000ng/ml，作用 48 小時(shí)后，U266B1 細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率從（6.61±0.67）%增加到（7.06±0.28）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于NCI-H929 細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率從（5.59±0.03）%增加到（27.13±1.35）%。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。依據(jù)兩獨(dú)立樣本的 t 檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，rmhTRAIL 對(duì)于 U266B1 細(xì)胞的凋亡作用 p＜0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而 rmhTRAIL 對(duì)于 NCI-H929 的凋亡有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4 rmhTRAIL 處理 MM 細(xì)胞對(duì) miR-17-5p 和 miR-886-5p 的定量分析1.2

ea 代表 E（rmhTRAIL），eb 代表 E（BTZ）。E（rmhTRAIL）rmhTRAIL 單獨(dú)處理的細(xì)胞抑制率，e（BTZ）為 BTZ 單獨(dú)處理的細(xì)胞抑率，e（rmhTRAIL+BTZ）為兩藥合并處理的細(xì)胞抑制率。計(jì)算 q 值，若在 0.85-1.15 之間，則兩藥作用單純相加，其值在 1.15-2.0 之間，兩藥表協(xié)同作用，其值大于 2.0，則兩藥聯(lián)合作用明顯增強(qiáng)，，若其值在 0.85-0.5間，則兩藥表現(xiàn)為拮抗作用，而小于 0.55 則為明顯拮抗。對(duì)于 U266B1 細(xì)胞，q 值為 0.85，而對(duì)于 NCI-H929 細(xì)胞，q 值達(dá)到了1.21，兩種藥物出現(xiàn)了增強(qiáng)的協(xié)同作用。證明了對(duì)于 U266B1 細(xì)胞，兩藥為單純相加，而對(duì)于 NCI-H929 細(xì)胞，兩藥表現(xiàn)為協(xié)同作用。2.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量凋亡
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2635374