【摘要】：研究背景及意義:結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,我國(guó)每年新增CRC 37.6萬(wàn)例,且每年新發(fā)病例仍在持續(xù)增長(zhǎng)。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,遺傳學(xué)和流行病學(xué)等方面的研究認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳因素包括家族性息肉病、遺傳性非息肉病、炎癥性腸病。大量攝入脂肪、肉類和酒精會(huì)增加患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。而膳食纖維素及鈣的攝入則會(huì)降低結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。病因?qū)W的研究結(jié)果表明腺瘤樣息肉是絕大部分結(jié)直腸癌的癌前病變。手術(shù)治療及放化療為治療結(jié)直腸癌的主要手段,但標(biāo)準(zhǔn)化療失敗后的晚期CRC患者,尤其是中國(guó)患者,能夠選擇的有效且可耐受的治療方案非常有限。因此,闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的分子治療靶標(biāo),進(jìn)行靶向治療已成為亟待解決的問(wèn)題。泛素化修飾是一種最常見的翻譯后修飾,是蛋白質(zhì)在翻譯后,通過(guò)將泛素分子結(jié)合到靶蛋白上,形成多聚泛素鏈,進(jìn)而被26s蛋白酶體識(shí)別降解。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)是一類類泛素樣分子,在結(jié)構(gòu)上與泛素分子相似,也參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾,但SUMO化修飾與泛素化修飾使靶蛋白具有截然不同的命運(yùn)。泛素化修飾介導(dǎo)靶蛋白的蛋白酶體降解,而SUMO化修飾具有可逆性的,參與靶蛋白的定位及功能調(diào)節(jié),在細(xì)胞分裂、增殖、分化以及衰老等生命進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明,SUMO修飾參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。UBA2(Ubiquitin-like modifier activating enzyme2)作為SUMO化過(guò)程中E1激活酶的重要組分,在SUMO化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)UBA2在肺癌、肝癌及胃癌組織中表達(dá)增高,并且與腫瘤的病理分化程度、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性密切相關(guān)。然而,UBA2在結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用研究較少�；赨BA2在肺癌、肝癌及胃癌發(fā)病中的作用,我們假設(shè)UBA2參與了結(jié)直腸癌的形成及發(fā)展,抑制UBA2表達(dá)能有效抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展。為了驗(yàn)證上述假設(shè),本研究首先觀察UBA2 mRNA和蛋白質(zhì)在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平,并分析其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者存活率的關(guān)系。進(jìn)而,以RKO和HCT116細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)轉(zhuǎn)染si(small interfering)-UBA2,探討了UBA2對(duì)細(xì)胞增值的促進(jìn)作用及機(jī)制;并在裸鼠皮下注射si-UBA2-RKO構(gòu)建人結(jié)直腸癌移植瘤模型,觀察UBA2在體內(nèi)對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的影響。通過(guò)以上研究,揭示UBA2在人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制,為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供了新靶點(diǎn)。方法:(1)收集2009-2010吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院手術(shù)切除237例結(jié)直腸癌及癌旁組織,懫用實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)和免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry,IHC)的方法,檢測(cè)UBA2在癌組織和癌旁組織中的表達(dá);并比較UBA2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。(2)體外實(shí)驗(yàn)部分:(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將UBA2特異性siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116,通過(guò)g418抗性篩選獲得穩(wěn)定低表達(dá)UBA2細(xì)胞株;(2)采用RT-PCR和Western blot(WB)方法檢測(cè)穩(wěn)定低表達(dá)UBA2的RKO和HCT116細(xì)胞中,UBA2的mRNA及蛋白表達(dá)水平;(3)采用MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、PI染色流式細(xì)胞細(xì)胞術(shù)以及Annexin V-APC單染流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)UBA2對(duì)RKO和HCT116細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及凋亡的影響;(4)采用WB方法檢測(cè)UBA2對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(P21、P27、CyclinB1)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、BAD)以及與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)信號(hào)通路(PI3K/Akt信號(hào)通路)中關(guān)鍵蛋白p-Akt的表達(dá)。(3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:(1)裸鼠皮下注射si-UBA2-RKO細(xì)胞構(gòu)建人結(jié)直腸癌移植瘤模型;(2)連續(xù)兩周每隔一天監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)和體重,隔天用卡尺測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積(V)用公式計(jì)算:V=L x W2=2;W為寬度,L為長(zhǎng)度。結(jié)果:(1)與癌旁組織相比,UBA2 mRNA和蛋白在結(jié)腸癌癌組織中表達(dá)水平顯著增高(P0.05);同時(shí)我們利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)分析了344例結(jié)直腸癌和28例正常結(jié)直腸組織中UBA2 mRNA的表達(dá)水平,與我們的結(jié)果一致,UBA2mRNA在結(jié)腸癌癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常組織(P0.01)。為了闡明UBA2表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系,我們對(duì)237例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了84個(gè)月的隨訪,結(jié)果發(fā)現(xiàn)病人的腫瘤組織中高表達(dá)UBA2的存活率顯著低于UBA2低表達(dá)者(P0.05)。(2)UBA2的表達(dá)依賴于腫瘤的位置、病理分化程度和TNM分期,與年齡、性別、淋巴結(jié)及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)。(3)體外實(shí)驗(yàn):通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染UBA2特異性siRNA,成功構(gòu)建了UBA2表達(dá)下調(diào)的RKO和HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞系,real time PCR和western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染UBA2特異性siRNA后,RKO和HCT116細(xì)胞的UBA2 mRNA和蛋白水平出現(xiàn)明顯降低。MTT和克隆形成結(jié)果顯示,UBA2表達(dá)降低后,RKO和HCT116細(xì)胞增殖能力減弱。細(xì)胞周期分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了UBA2表達(dá)降低抑制RKO和HCT116細(xì)胞的增殖。UBA2表達(dá)降低后,RKO和HCT116細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。WB結(jié)果顯示UBA2表達(dá)降低后,CyclinB1表達(dá)降低,P21和P27表達(dá)明顯增高。凋亡結(jié)果顯示,UBA2表達(dá)降低后,RKO和HCT116細(xì)胞凋亡增高。Western blot結(jié)果顯示,Bcl-2蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平下調(diào)。(4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):裸鼠皮下注射si-UBA2-RKO細(xì)胞構(gòu)建人結(jié)直腸癌移植瘤模型。與對(duì)照組相比,UBA2低表達(dá)腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢。在荷瘤2周后,將小鼠處死并分離腫瘤,腫瘤重量也進(jìn)一步說(shuō)明UBA2低表達(dá)可延緩腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)論:(1)UBA2 mRNA和蛋白在人結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào),與結(jié)直腸癌的增殖呈正相關(guān),而與臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān),提示UBA2可能參與人結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。(2)利用低表達(dá)UBA2的體外結(jié)直腸癌細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)UBA2表達(dá)下調(diào)可使結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。其機(jī)制可能與誘導(dǎo)P21和P27表達(dá),下調(diào)Cyclin B1、Bcl2、p-Akt表達(dá)有關(guān)。(3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低表達(dá)UBA2的腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度明顯變緩,說(shuō)明UBA2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)。提示,UBA2有可能成為結(jié)直腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 UBA2 在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義3.1.1 人結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中UBA2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) 237 例結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中 UBA2 蛋白的表達(dá)水平，real time RT-PCR 檢測(cè) 33 例結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中 UBA2 mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，，與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中 UBA2 mRNA 表達(dá)水平明顯增高，差異顯著（P<0.05）（圖 3.1）。免疫組化結(jié)果顯示，UBA2 蛋白的陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核中，呈不同程度的黃色至棕褐色顆粒，與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中 UBA2 蛋白的表達(dá)水平顯著增高（圖 3.2）。

3.2 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中 UBA2 蛋白的表達(dá)水平2 protein expression in adjacent normal colorectal tissue (A) and CRC ti癌UBA2蛋白的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性表 3.1 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征分析 Clinicopathological characteristics of patients with colorectal canathologicalatureUBA2 expressionTotal P-valuNegative Positivef patients 35 202 237s) 0.11020 86 10615 116 1310.05824 98 122e 11 104 115
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34

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4 朱s

本文編號(hào)：2634635