發(fā)布時間：2020-04-20 08:22

【摘要】：急性淋巴白血病是淋巴細胞在骨髓內(nèi)異常增生引起的惡性腫瘤性疾病。其惡性腫瘤細胞不僅能夠損害骨髓,抑制正常的造血功能,同時由于該腫瘤細胞易擴散也會損害到骨髓外的其他組織(如腦膜、淋巴結(jié)、肝等)。據(jù)報道,我國急性淋巴白血病的發(fā)病率為0.69/10萬,其中青少年和兒童為高發(fā)病率群體,嚴重威脅人類的生命健康。因此,發(fā)展特異性高、靈敏度好的急性淋巴白血病檢測方法,以實現(xiàn)其早期診斷來實施及時有效的治療,對于減輕患者痛苦和提高治愈率具有重大意義。常見急性淋巴白血病早期診斷的方法有:免疫分析法、基因檢測法、納米檢測法、光譜法等。這些方法由于檢測的靈敏度較低、操作過程復(fù)雜、實驗時間長等原因限制了其適用范圍。核酸適配體(Aptamer),它是指某種人工合成的單鏈DNA或RNA分子,它們能夠通過分子內(nèi)作用力折疊成二級或三級結(jié)構(gòu)從而對某種目標(biāo)分子具有很強的特異結(jié)合的性能。由于核酸適配體不僅擁有抗體的主要性質(zhì),同時彌補了抗體的一些缺陷,而且還具有易合成、靶目標(biāo)物豐富、修飾簡單等優(yōu)點,被研究者譽為“化學(xué)抗體”。此外,常被應(yīng)用于高靈敏度檢測核苷酸鏈的核酸等溫擴增技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)比較成熟和完善,其可在某一特定溫度下快速擴增出106-109倍(呈指數(shù)形式)目標(biāo)核苷酸鏈�；谝陨戏治�,本論文以發(fā)展新型的腫瘤細胞檢測方法為目標(biāo),通過結(jié)合核酸適配體可用作新型腫瘤靶向識別分子的優(yōu)點和核酸等溫擴增技術(shù)能夠高靈敏檢測核苷酸鏈的性質(zhì),構(gòu)建了一種新型檢測急性淋巴白血病細胞(CCRF-CEM)的方法,并結(jié)合實時熒光定量手段對該腫瘤細胞進行了高靈敏、高特異性的檢測研究。具體研究內(nèi)容和主要結(jié)論如下:一、基于核酸適配體的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)法檢測急性淋巴白血病細胞(CCRF-CEM)的研究在常規(guī)腫瘤細胞檢測中,為了減小抗體受環(huán)境因素的影響,利用核酸適配體作為腫瘤細胞靶向識別分子,同時結(jié)合具有高靈敏的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)來實現(xiàn)對腫瘤細胞的高靈敏、高特異性的檢測。在該項研究方案中,以CCRF-CEM細胞作為檢測對象,選擇其特異性的核酸適配體sgc8c作為捕獲該細胞的識別分子,設(shè)計一個含有sgc8c序列的LAMP擴增反應(yīng)雙莖環(huán)模板,當(dāng)該雙莖環(huán)模板與CCRF-CEM細胞孵育一段時間后,核酸適配體將特異性捕獲腫瘤細胞,再通過洗滌除掉未被結(jié)合上細胞的雙莖環(huán)鏈,然后進行下一步LAMP擴增反應(yīng),通過對雙莖環(huán)的定量檢測,便可實現(xiàn)對CCRF-CEM細胞的定量分析。該方法可以特異性的檢測出CCER-CEM細胞的數(shù)量為1000個,這為實現(xiàn)高特異性和高靈敏度的腫瘤細胞的檢測提供了一種新的思路。二、基于磁分離技術(shù)的恒溫指數(shù)擴增(EXPAR)法檢測腫瘤細胞的研究基于以上研究思路,繼續(xù)以CCRF-CEM細胞作為檢測的目標(biāo)細胞,探究利用EXPAR擴增技術(shù)來實現(xiàn)高靈敏的腫瘤細胞的檢測。EXPAR技術(shù)與LAMP技相比,設(shè)計更為簡便,所需擴增時間更短,而且利用磁球(MB)來連接核酸適配體會更加牢固,磁分離技術(shù)也更易實現(xiàn)監(jiān)控和去除。具體研究方案如下,首先將修飾好的磁球連接上核酸適配體sgc8c,再設(shè)計一條寡核苷酸鏈可互補雜交于該核酸適配體上。然后將此復(fù)合物(磁球-核酸適配體-寡核苷酸鏈)與CCRF-CEM細胞共同孵育一段時間后,核酸適配體sgc8c就會捕獲CCRF-CEM細胞,從而釋放出寡核苷酸鏈。繼續(xù)以此寡核苷酸鏈作為EXPAR擴增反應(yīng)的目標(biāo)鏈,再設(shè)計一條EXPAR擴增的雙功能型模板鏈,便于下一步擴增反應(yīng)。實驗結(jié)果可通過對寡核苷酸鏈的實時檢測來實現(xiàn)對腫瘤細胞的檢測。該方法結(jié)合了核酸適配體和等溫指數(shù)擴增二者的優(yōu)勢可高靈敏的實現(xiàn)10個目標(biāo)細胞的檢測,線性范圍可跨越3個數(shù)量級,構(gòu)建了一種簡便、高效、可操作性高的腫瘤細胞的檢測方法。除此之外,通過選擇不同的核酸適配體可實現(xiàn)對不同的腫瘤細胞的捕獲,從而實現(xiàn)對不同腫瘤細胞的高特異性檢測,這在腫瘤細胞檢測方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?br>【圖文】：

Ｃ＾－Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ＤＮＡ逡逑ｆｃｌｏｏｆｎｇ邋＋邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑圖１．１基于Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ技術(shù)篩選Ａｐｔａｍｅｒ原理示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ａｐｔａｍｅｒ邋ｕｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ逡逑近年來，核酸適配體可以在體外用來識別不同的腫瘤細胞［９］，又因為其某些逡逑獨特的性質(zhì)，使得它們有可能成為比抗體更有效的選擇對象。核酸適配體的優(yōu)勢：逡逑第一，它們能從合成庫中進行體外篩選；第二，一旦篩選成功，就可通過聚合酶逡逑鏈式反應(yīng)進行持續(xù)擴增，擴增產(chǎn)物不僅量多，而且質(zhì)優(yōu)？，第三，由于核酸適配體逡逑化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單＂°］，因此可以根據(jù)不同目的對其進行化學(xué)修飾；第四，核酸適配體逡逑比抗體在某些極端情況下（例如：溫度、鹽度、極端ｐＨ條件的耐受力等）表現(xiàn)逡逑的更加穩(wěn)定。被選擇上的核酸適配體具有高親和性［１１］，細胞特異性以及它們能篩逡逑選出表面沒有生物標(biāo)記物的特定類型的腫瘤細胞等優(yōu)勢。更為重要的是，，核酸適逡逑配體若與寡核苷酸鏈通過堿基互補配對原理雜交成特定的結(jié)構(gòu)［１２］

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ａｐｔａｓｅｎｓｏｒ逡逑于核酸適配體的熒光檢測法逡逑華教授帶領(lǐng)的團隊依然以核酸適配體為基礎(chǔ)，但是通過利用熒光實現(xiàn)了對腫瘤細胞的檢測［２９］。該實驗原理如圖１．４所示，單鏈的富含Ｇ序列，它可增敏Ｔｂ３＋熒光。核酸適配體探針（ＡＰ）為ＳＰ時其也可與蛋白ＭＵＣＩ特異性結(jié)合。當(dāng)體系中存在乳腺癌細胞核酸適配體探針便會快速的識別ＭＣＦ－７細胞并與其相結(jié)合，經(jīng)Ｐ探針和Ｔｂ３＋離子。由于溶液中的核酸適配體探針結(jié)合了腫瘤細與ＳＰ探針相互雜交，而ＳＰ探針與Ｔｂ３＋共同存在時，便可增強可以通過加入ＳＰ，邋Ｔｂ３＋離子前后的熒光信號變化情況來實現(xiàn)對乳檢測。若體系中不存在ＭＣＦ－７細胞，ＡＰ探針就會和ＡＰ探針相互強Ｔｂ３＋的熒光信號。該實驗的最低檢出限為７０個細胞，實驗數(shù)據(jù)細胞范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。逡逑Ｘｅｘ邋２９０ｚｎｎ邋Ｘｃｍ邋５４０邋ｎｍ逡逑．ｍ邋４邋二邋”Ｃｎ邐ＡｄｄＴｂ＼邋■邐＾逡逑
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.71;R730.43

【參考文獻】

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1 陳秋香;趙燕蘋;吳冬枝;蔡淑賢;夏W毨

本文編號：2634340