【摘要】：急性淋巴白血病是淋巴細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生引起的惡性腫瘤性疾病。其惡性腫瘤細(xì)胞不僅能夠損害骨髓,抑制正常的造血功能,同時(shí)由于該腫瘤細(xì)胞易擴(kuò)散也會(huì)損害到骨髓外的其他組織(如腦膜、淋巴結(jié)、肝等)。據(jù)報(bào)道,我國急性淋巴白血病的發(fā)病率為0.69/10萬,其中青少年和兒童為高發(fā)病率群體,嚴(yán)重威脅人類的生命健康。因此,發(fā)展特異性高、靈敏度好的急性淋巴白血病檢測(cè)方法,以實(shí)現(xiàn)其早期診斷來實(shí)施及時(shí)有效的治療,對(duì)于減輕患者痛苦和提高治愈率具有重大意義。常見急性淋巴白血病早期診斷的方法有:免疫分析法、基因檢測(cè)法、納米檢測(cè)法、光譜法等。這些方法由于檢測(cè)的靈敏度較低、操作過程復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長等原因限制了其適用范圍。核酸適配體(Aptamer),它是指某種人工合成的單鏈DNA或RNA分子,它們能夠通過分子內(nèi)作用力折疊成二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)從而對(duì)某種目標(biāo)分子具有很強(qiáng)的特異結(jié)合的性能。由于核酸適配體不僅擁有抗體的主要性質(zhì),同時(shí)彌補(bǔ)了抗體的一些缺陷,而且還具有易合成、靶目標(biāo)物豐富、修飾簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),被研究者譽(yù)為“化學(xué)抗體”。此外,常被應(yīng)用于高靈敏度檢測(cè)核苷酸鏈的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)比較成熟和完善,其可在某一特定溫度下快速擴(kuò)增出106-109倍(呈指數(shù)形式)目標(biāo)核苷酸鏈�；谝陨戏治�,本論文以發(fā)展新型的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法為目標(biāo),通過結(jié)合核酸適配體可用作新型腫瘤靶向識(shí)別分子的優(yōu)點(diǎn)和核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能夠高靈敏檢測(cè)核苷酸鏈的性質(zhì),構(gòu)建了一種新型檢測(cè)急性淋巴白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)的方法,并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量手段對(duì)該腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了高靈敏、高特異性的檢測(cè)研究。具體研究?jī)?nèi)容和主要結(jié)論如下:一、基于核酸適配體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法檢測(cè)急性淋巴白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)的研究在常規(guī)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中,為了減小抗體受環(huán)境因素的影響,利用核酸適配體作為腫瘤細(xì)胞靶向識(shí)別分子,同時(shí)結(jié)合具有高靈敏的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的高靈敏、高特異性的檢測(cè)。在該項(xiàng)研究方案中,以CCRF-CEM細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象,選擇其特異性的核酸適配體sgc8c作為捕獲該細(xì)胞的識(shí)別分子,設(shè)計(jì)一個(gè)含有sgc8c序列的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)雙莖環(huán)模板,當(dāng)該雙莖環(huán)模板與CCRF-CEM細(xì)胞孵育一段時(shí)間后,核酸適配體將特異性捕獲腫瘤細(xì)胞,再通過洗滌除掉未被結(jié)合上細(xì)胞的雙莖環(huán)鏈,然后進(jìn)行下一步LAMP擴(kuò)增反應(yīng),通過對(duì)雙莖環(huán)的定量檢測(cè),便可實(shí)現(xiàn)對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞的定量分析。該方法可以特異性的檢測(cè)出CCER-CEM細(xì)胞的數(shù)量為1000個(gè),這為實(shí)現(xiàn)高特異性和高靈敏度的腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)提供了一種新的思路。二、基于磁分離技術(shù)的恒溫指數(shù)擴(kuò)增(EXPAR)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的研究基于以上研究思路,繼續(xù)以CCRF-CEM細(xì)胞作為檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞,探究利用EXPAR擴(kuò)增技術(shù)來實(shí)現(xiàn)高靈敏的腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。EXPAR技術(shù)與LAMP技相比,設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便,所需擴(kuò)增時(shí)間更短,而且利用磁球(MB)來連接核酸適配體會(huì)更加牢固,磁分離技術(shù)也更易實(shí)現(xiàn)監(jiān)控和去除。具體研究方案如下,首先將修飾好的磁球連接上核酸適配體sgc8c,再設(shè)計(jì)一條寡核苷酸鏈可互補(bǔ)雜交于該核酸適配體上。然后將此復(fù)合物(磁球-核酸適配體-寡核苷酸鏈)與CCRF-CEM細(xì)胞共同孵育一段時(shí)間后,核酸適配體sgc8c就會(huì)捕獲CCRF-CEM細(xì)胞,從而釋放出寡核苷酸鏈。繼續(xù)以此寡核苷酸鏈作為EXPAR擴(kuò)增反應(yīng)的目標(biāo)鏈,再設(shè)計(jì)一條EXPAR擴(kuò)增的雙功能型模板鏈,便于下一步擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可通過對(duì)寡核苷酸鏈的實(shí)時(shí)檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。該方法結(jié)合了核酸適配體和等溫指數(shù)擴(kuò)增二者的優(yōu)勢(shì)可高靈敏的實(shí)現(xiàn)10個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的檢測(cè),線性范圍可跨越3個(gè)數(shù)量級(jí),構(gòu)建了一種簡(jiǎn)便、高效、可操作性高的腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法。除此之外,通過選擇不同的核酸適配體可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞的捕獲,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的高特異性檢測(cè),這在腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?br>【圖文】：

Ｃ＾－Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ＤＮＡ逡逑ｆｃｌｏｏｆｎｇ邋＋邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑圖１．１基于Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ技術(shù)篩選Ａｐｔａｍｅｒ原理示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ａｐｔａｍｅｒ邋ｕｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ逡逑近年來，核酸適配體可以在體外用來識(shí)別不同的腫瘤細(xì)胞［９］，又因?yàn)槠淠承╁义溪?dú)特的性質(zhì)，使得它們有可能成為比抗體更有效的選擇對(duì)象。核酸適配體的優(yōu)勢(shì)：逡逑第一，它們能從合成庫中進(jìn)行體外篩選；第二，一旦篩選成功，就可通過聚合酶逡逑鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行持續(xù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物不僅量多，而且質(zhì)優(yōu)？，第三，由于核酸適配體逡逑化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單＂°］，因此可以根據(jù)不同目的對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾；第四，核酸適配體逡逑比抗體在某些極端情況下（例如：溫度、鹽度、極端ｐＨ條件的耐受力等）表現(xiàn)逡逑的更加穩(wěn)定。被選擇上的核酸適配體具有高親和性［１１］，細(xì)胞特異性以及它們能篩逡逑選出表面沒有生物標(biāo)記物的特定類型的腫瘤細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)。更為重要的是，，核酸適逡逑配體若與寡核苷酸鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原理雜交成特定的結(jié)構(gòu)［１２］

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ａｐｔａｓｅｎｓｏｒ逡逑于核酸適配體的熒光檢測(cè)法逡逑華教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)依然以核酸適配體為基礎(chǔ)，但是通過利用熒光實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)［２９］。該實(shí)驗(yàn)原理如圖１．４所示，單鏈的富含Ｇ序列，它可增敏Ｔｂ３＋熒光。核酸適配體探針（ＡＰ）為ＳＰ時(shí)其也可與蛋白ＭＵＣＩ特異性結(jié)合。當(dāng)體系中存在乳腺癌細(xì)胞核酸適配體探針便會(huì)快速的識(shí)別ＭＣＦ－７細(xì)胞并與其相結(jié)合，經(jīng)Ｐ探針和Ｔｂ３＋離子。由于溶液中的核酸適配體探針結(jié)合了腫瘤細(xì)與ＳＰ探針相互雜交，而ＳＰ探針與Ｔｂ３＋共同存在時(shí)，便可增強(qiáng)可以通過加入ＳＰ，邋Ｔｂ３＋離子前后的熒光信號(hào)變化情況來實(shí)現(xiàn)對(duì)乳檢測(cè)。若體系中不存在ＭＣＦ－７細(xì)胞，ＡＰ探針就會(huì)和ＡＰ探針相互強(qiáng)Ｔｂ３＋的熒光信號(hào)。該實(shí)驗(yàn)的最低檢出限為７０個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)細(xì)胞范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。逡逑Ｘｅｘ邋２９０ｚｎｎ邋Ｘｃｍ邋５４０邋ｎｍ逡逑．ｍ邋４邋二邋”Ｃｎ邐ＡｄｄＴｂ＼邋■邐＾逡逑
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733.71;R730.43

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳秋香;趙燕蘋;吳冬枝;蔡淑賢;夏W毨

本文編號(hào)：2634340