【摘要】：目的:本實驗研究的主要目的是檢測SNORD82在肝癌細胞中的表達,檢驗其表達量與肝癌細胞侵襲能力的相關性,利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術構建SNORD82被穩(wěn)定抑制表達的肝癌細胞株,為后續(xù)功能學試驗及靶基因作用原理研究提供理論依據(jù)與參考。方法:1、q RT-PCR檢測肝癌細胞株(HCCLM3、Hep G2、Huh-7)與正常肝細胞(HL-7702)SNORD82的表達水平;2、構建抑制SNORD82表達的慢病毒載體,包裝并感染高表達的肝癌細胞株;3、熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率,q RT-PCR檢測SNORD82的表達水平。結果:1、q RT-PCR結果顯示:SNORD82在正常肝細胞株(HL-7702)和肝癌細胞株(HCCLM3Hep G2Huh-7)都有檢測到。SNORD82在HCCLM3細胞系中相對表達量是5.580±0.121,Hep G2細胞系中相對表達量是3.521±0.130,Huh-7細胞系中相對表達量是1.417±0.120,正常肝細胞(HL-7702)中相對表達量是0.924±0.142,兩個組間相互對比,表達量差異明顯(P0.05)。SNORD82在四種細胞系中的表達水平從高到低依次為:HCCLM3Hep G2Huh-7HL-7702。2、取4×108TU/ml滴度的SNORD82-RNAi慢病毒,然后感染肝癌細胞株,熒光顯微鏡觀察它的轉(zhuǎn)染效率,得到穩(wěn)定表達的肝癌細胞株。SNORD82-RNAi慢病毒感染的細胞株定義為KD-HCCLM3,陰性對照病毒感染細胞株定義為NC-HCCLM3。通過熒光實時定量PCR檢測3株肝癌細胞(HCCLM3、NC-HCCLM3、KD-HCCLM3)SNORD82的數(shù)據(jù)表明:SNORD82在HCCLM3細胞中相對表達量是(2.51±0.18),NC-HCCLM3組相對表達量是(2.38±0.21),KD-HCCLM3組相對表達量是(0.527±0.36),HCCLM3組與NC-HCCLM3組對比,差異不顯著(P0.05)。KD-HCCLM3組分別同HCCLM3、NC-HCCLM3組對比,其表達量明顯降低(P0.05)。結論:1、SNORD82在肝癌細胞中表達上調(diào),且與細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力成正相關。2、利用慢病毒轉(zhuǎn)染抑制HCCLM3中SNORD82的表達,成功構建慢病毒細胞株。
【圖文】：

圖 3.1 GV248 載體 I 進行位點雙酶切。82 前體序列：GGAGTATGTTGACCACTGCGCAATCTGAGTGCTTATATGATCAGGTCCCATT 合成引物序列：AGGTGATGGAGTATGTTCTCGAGAACATACT’ACCAGGTGATGGAGTATGTTCTCGAGAACA測序：TGTTAGAGAGANAATTGGATTAATTTGACTGCAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTC

圖 3.2 pHelper 1.0 載體圖譜 圖 3.3 pHelper 2.0 載體圖譜（1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與慢病毒收獲：① 轉(zhuǎn)染前 24 h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的 293T 細胞，以含 10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度約5 x 106細胞/15 ml，，重新接種10 cm細胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h 待細胞密度達 70%～80%時即可用于轉(zhuǎn)染；② 轉(zhuǎn)染前 2 h 更換為無血清培養(yǎng)基；③ 向一滅菌離心管中加入所制備的各 DNA 溶液(GV 載體質(zhì)粒 20μg、pHelper 1.0 載體質(zhì)粒 15μg、pHelper 2.0 載體質(zhì)粒 10μg)，與相應體積的吉凱轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，調(diào)整總體積為 1 ml，在室溫下溫育 15 min；④ 混合液緩慢滴加至 293T 細胞培養(yǎng)液中，混勻，于 37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑤ 培養(yǎng) 6 h 后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，加入 10 ml 的 PBS 液清洗一
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

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本文編號：2633460