【摘要】：【研究背景】Hedgehog信號通路是調(diào)節(jié)昆蟲和胚胎發(fā)育的經(jīng)典信號通路之一。Hedgehog信號通路在多個腫瘤中呈現(xiàn)出來了高度活化狀態(tài),包括結(jié)直腸癌,胰腺癌,髓母細胞瘤等等。多種證據(jù)表明Hedgehog信號通路的活化與腫瘤生長發(fā)育相關(guān),因此也已經(jīng)有相對應(yīng)的靶向化合物出現(xiàn),并且對腫瘤有一定的治療效果。在腫瘤治療中,誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡是重要治療手段之一,凋亡的腫瘤細胞會被機體清除從而治愈腫瘤。因此,鑒定研究具有促凋亡活性的新型Hedgehog信號通路抑制劑對對于腫瘤治療具有重要意義�！狙芯磕康摹窟x擇和運用合適的小分子化合物篩選方案去篩選具有促凋亡活性的新型Hedgehog信號通路抑制劑。從分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)等多個層面設(shè)計研究方案對發(fā)現(xiàn)的小分子化合物鑒定研究,闡明其作用機理和抗腫瘤作用,為腫瘤治療提供新的方向�！狙芯糠椒ā繛榱髓b定出可以誘導(dǎo)細胞凋亡的Hedgehog通路抑制劑,我們對于細胞進行凋亡抑制劑z-VAD預(yù)處理,然后利用合作的化合物合成課題組合成的300多個新型Hedgehog小分子抑制劑文庫進行篩選,通過最終細胞ATP水平分析細胞存活率,結(jié)果鑒定出來一個促凋亡的小分子化合物Hh003。為了進一步確定Hh003誘導(dǎo)的細胞死亡是不是凋亡,我們對于Hh003處理的細胞進行了臺盼藍染色;同時也通過了運用流式細胞技術(shù)去檢測Hh003處理之后的細胞的Annexin V/PI的陽性率。另一方面,為了鑒定小分子化合物Hh003對于Hedgehog信號通路的抑制作用,我們選用了一個上市藥Vismodegib作為對照,同時構(gòu)建了NIH3T3-GRE-Luc這個報告系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)小分子化合物Hh003對于Hedgehog的抑制作用明顯好于Vismodegib,同時也對Hedgehog信號通路的關(guān)鍵基因GLI1和PTCH1有抑制作用。為了進一步闡明小分子化合物Hh003誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制,我們通過免疫印跡實驗檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase8和Caspase9的切割,以及Caspase蛋白底物PARP的切割,并且運用si RNA沉默技術(shù)去鑒定具體凋亡途徑,同時通過ELISA檢測了小分子化合物Hh003對于腫瘤細胞自分泌TNF-ɑ的影響。此外,我們還檢測了小分子化合物Hh003對于細胞克隆形成的影響。最后為了鑒定小分子化合物Hh003的抗腫瘤作用,我們構(gòu)建了人結(jié)腸癌細胞HCT116的裸鼠移植瘤模型,進一步探究其體內(nèi)抗腫瘤作用�！狙芯拷Y(jié)果】(1)通過Hedgehog抗腫瘤文庫篩選我們鑒定出來了可以誘導(dǎo)細胞死亡的小分子化合物Hh003;(2)小分子化合物Hh003誘導(dǎo)的細胞死亡可以被凋亡抑制劑z-VAD抑制;(3)小分子化合物Hh003處理的腫瘤細胞呈現(xiàn)臺盼藍染色陽性;(4)小分子化合物Hh003處理的腫瘤細胞在流式檢測中呈現(xiàn)Annexin V/PI陽性升高;(5)小分子化合物Hh003對于Hedgehog信號通路具有抑制作用;(6)小分子化合物Hh003可以抑制Hedgehog信號通路關(guān)鍵基因GLI1和PTCH1的轉(zhuǎn)錄水平;(7)小分子化合物Hh003處理腫瘤細胞后引起PARP和Caspase8活化;(8)小分子化合物Hh003誘導(dǎo)的細胞凋亡會被Caspase8沉默所阻止,而Caspase9的沉默不行;(9)小分子化合物Hh003不影響腫瘤細胞TNF-ɑ的自分泌;(10)小分子化合物Hh003會明顯抑制腫瘤細胞的克隆形成;(11)小分子化合物Hh003能夠在裸鼠體內(nèi)一定程度上抑制人結(jié)腸癌細胞瘤HCT116的生長�！窘Y(jié)論】我們研究結(jié)果表明,我們發(fā)現(xiàn)了具有促凋亡活性的小分子化合物Hh003,它通過激活了Caspase8依賴的細胞凋亡外源性途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,同時也抑制了Hedgehog信號通路。并且體內(nèi)實驗表明,小分子化合物Hh003對于人結(jié)腸癌細胞HCT116誘導(dǎo)的腫瘤生長也有一定的抑制作用。這些結(jié)果對于新型Hedgehog抑制劑的研發(fā)具有指導(dǎo)意義,也為治愈腫瘤提供新的方向。
【圖文】：

gehog 信號通路抑制劑的鑒定與功能研究 結(jié)結(jié) 果1．在Hedgehog抑制劑文庫中篩選到可以誘導(dǎo)細胞死亡的小分子化合物H靶向 HH 信號通路的化合物可以用來治療基底細胞癌，目前研發(fā)出來的靶向 HH的主要有 2 個上市藥，分別是 Vismodegib 和 Sonidegib。但是兩個化合物各有其方，Vismodegib 的可溶性比較差，并且出現(xiàn)耐藥性，而 Sonidegib 則是存在著一些包括輕微的會肌肉痙攣、以及失去味覺和脫發(fā)，嚴重的甚至?xí)鸺∪饨M織分解此，我們必須去研發(fā)新型的靶向 HH 信號通路的抑制劑。我們和其他的化合物研發(fā)課題組合作，合成了 300 多個靶向 HH 信號通分子化合物，在這其中去篩選能夠在細胞中誘導(dǎo)凋亡的小分子化合物，并其對細胞的毒性作用。

果 Hedgehog 信號通路抑制劑的鑒定與功能研究2．小分子化合物 Hh003 在多個腫瘤細胞中誘導(dǎo)細胞死亡我們通過篩選發(fā)現(xiàn)了可以誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的小分子化合物 Hh003，為了進步確認 Hh003 誘導(dǎo)的腫瘤細胞死亡是不是普遍存在的現(xiàn)象，以及其對正常細胞無生理毒性，，我們在多個腫瘤細胞系和一株正常細胞系中用不同濃度的 Hh003理，觀察其對細胞存活率的影響。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2

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本文編號：2626913