【摘要】：胰腺癌(Pancreatic cancer)在腫瘤導(dǎo)致死亡中位居第四位,具有進(jìn)展迅速、轉(zhuǎn)移早、放化療抵制等特點(diǎn)。目前,胰腺癌基礎(chǔ)及臨床相關(guān)研究雖然獲得了一些進(jìn)展,但五年生存率仍維持在5%左右。針對(duì)胰腺癌的有效診療手段仍然任重而道遠(yuǎn)。探索胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程及其確切機(jī)制,仍然是當(dāng)前胰腺癌基礎(chǔ)及臨床研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)。研究表明:應(yīng)激(缺氧、乏養(yǎng)、放化療)誘導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。病理研究顯示:作為一種乏血供腫瘤組織,胰腺癌組織中存在大面積的低氧乏氧區(qū)。近年來(lái),低氧誘導(dǎo)因子-1(Hyopxia induced factor-1)在實(shí)體瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用引起了越來(lái)越多的關(guān)注。針對(duì)胰腺癌的大規(guī)模臨床標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn):HIF-1a表達(dá)水平與胰腺癌預(yù)后呈高度負(fù)相關(guān),是誘導(dǎo)腫瘤增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸的關(guān)鍵分子。然而,其確切機(jī)制尚未完全闡明。本研究目的:(1)明確低氧條件下,HIF-1a誘導(dǎo)自噬在胰腺癌非干細(xì)胞去分化中的作用及其確切機(jī)制;(2)明確低氧條件下,HIF-1a誘導(dǎo)自噬在胰腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用及其確切機(jī)制;(3)篩選能與HIF-1a特異性配對(duì)結(jié)合的DNA寡核苷酸短鏈,合成多功能納米粒子,初步探討其應(yīng)用于胰腺癌干細(xì)胞體內(nèi)外磁共振靶向成像效果。研究?jī)?nèi)容和方法:(1)采用改良的Transwell分離實(shí)驗(yàn)方法,篩選人胰腺癌細(xì)胞系(Panc-1)中胰腺癌干細(xì)胞以及胰腺癌非干細(xì)胞;并利用流式細(xì)胞儀、成球?qū)嶒?yàn)、免疫熒光、Western Blot及體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分選出的胰腺癌細(xì)胞的干性;(2)將分選出的胰腺癌非干細(xì)胞培養(yǎng)在間歇性低氧條件下(1%氧氣、94%氮?dú)猸h(huán)境中培養(yǎng)12 h后,再在20%氧氣培養(yǎng)12 h,如此反復(fù)4次),利用干擾和沉默技術(shù),給予以下分組:(1)對(duì)照組;(2)胰腺癌非干細(xì)胞+HIF-1a si RNA;(3)胰腺癌非干細(xì)胞+3-MA(自噬抑制劑);(4)胰腺癌非干細(xì)胞+HIF-1a si RNA+3-MA。在以下時(shí)間點(diǎn)(24h,48h,72h),采用顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞成球能力及形態(tài),流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD133+細(xì)胞比例,RT-PCR及Western-blot分析細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平變化(Oct-4、c-MYC、CD44、HIF-1a、LC3-I、LC3-II、Beclin 1)。(3)將分選的胰腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)在間歇性低氧條件下(1%氧氣、94%氮?dú)猸h(huán)境中培養(yǎng)12 h后,再在20%氧氣培養(yǎng)12 h,如此反復(fù)4次),利用干擾和沉默技術(shù),給予以下分組:(1)對(duì)照組;(2)胰腺癌干細(xì)胞+HIF-1a si RNA;(3)胰腺癌干細(xì)胞+3-MA(自噬抑制劑);(4)胰腺癌干細(xì)胞+HIF-1a si RNA+3-MA。作用不同時(shí)間(24h,48h,72h)點(diǎn),觀察以下指標(biāo):Tranwell觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況;Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)含量變化(HIF-1a、CD133、CD44、E-Ca、Vementin、MMP-9、LC3-II、Beclin 1)。(4)γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短鏈納米顆粒合成和制備;分析其穩(wěn)定性及毒性。(5)胰腺癌干細(xì)胞、胰腺癌非干細(xì)胞與γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短鏈納米顆粒共浴,MTT及流式技術(shù)檢測(cè)納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響;普魯士藍(lán)染色及3.0T磁共振觀察納米粒子與胰腺癌干細(xì)胞、胰腺癌非干細(xì)胞結(jié)合的特異性及體外成像靶向性。(6)構(gòu)建胰腺癌裸鼠皮下瘤模型,尾靜脈注射γ-Fe3O4@DMSA及γ-Fe3O4@DMSA-DNA納米顆粒,注射后30min、1.5h、2h、24h等不同時(shí)間點(diǎn),采用3.0T磁共振觀察瘤體信號(hào)改變,測(cè)量T2弛豫時(shí)間。研究結(jié)果:(1)改良的Transwell分離實(shí)驗(yàn)可以作為分選腫瘤干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)手段之一,且該方法具有簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)。(2)間歇性缺氧條件下,HIF-1a可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬,促進(jìn)胰腺癌非干細(xì)胞去分化而獲得干細(xì)胞的表型和功能。(3)作為缺氧誘導(dǎo)的核心分子之一,HIF-1a在缺氧應(yīng)激條件下是促進(jìn)胰腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控分子,而其主要通過(guò)誘導(dǎo)胰腺癌干細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化及自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程。(4)與HIF配對(duì)的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子可以特異性結(jié)合到胰腺癌干細(xì)胞,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),結(jié)合效率逐漸增高。胰腺癌非干細(xì)胞可以結(jié)合少量的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子,但即使共育時(shí)間延長(zhǎng),結(jié)合效率也無(wú)明顯增高。同時(shí)胰腺癌干細(xì)胞結(jié)合納米磁粒子的時(shí)間明顯要早于胰腺癌非干細(xì)胞,這一時(shí)間梯度差,為臨床MRI檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞增加了可行性。(5)裸鼠皮下胰腺癌模型中,能特異結(jié)合HIF-1a的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子能在瘤體內(nèi)聚集,其與單純氧化鐵納米粒子在注射30min、1.5h、2h及24h后瘤體的T2弛豫時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:(1)在缺氧應(yīng)激條件下,HIF-1a通過(guò)自噬維持胰腺癌干細(xì)胞和胰腺癌非干細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡;并可以誘導(dǎo)胰腺癌干細(xì)胞通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)移。(2)氧化鐵納米粒偶聯(lián)能特異結(jié)合HIF-1a的DNA寡核苷酸短鏈(γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短鏈)較單純氧化鐵納米粒在體外能相對(duì)特異性的結(jié)合HIF高表達(dá)的胰腺癌干細(xì)胞;能特異性聚集在胰腺癌腫瘤組織內(nèi),并且能有效的改變相應(yīng)MR成像信號(hào)強(qiáng)度及T2豫馳時(shí)間。
【圖文】：

細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，仍未見(jiàn)克隆球生長(zhǎng) (圖2.1C-D) 。圖 2.1 下室及上室細(xì)胞生長(zhǎng)模式顯微鏡檢測(cè)結(jié)果Figure2.1 The sphere formation from the lower chamber cells and the upper chamber cells.A，下室培養(yǎng)基中成圓形的球形生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，克隆球體積增大。B，上室細(xì)胞呈平鋪貼壁生長(zhǎng)。2.2.2 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果將改良Transwell分離的上室及下室細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與上室細(xì)胞及總細(xì)胞系中細(xì)胞相比，下室細(xì)胞內(nèi)CD133+及CD44+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)均明顯升高。（圖2.2）

圖 2.2 下室及上室細(xì)胞中 CD133+及 CD44+細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果。Figure 2.2 The percentage of CD133+and CD44+subpopulations in theupper chamber cells.A：下室培養(yǎng)基中 CD133+比例增高；B：下室培養(yǎng)基中 CD44+比例增高T-PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果-PCR 及 Western-Blot 定量檢測(cè)結(jié)果顯示上室細(xì)胞、下室細(xì)胞及Oct-4 及 ESA 基因及蛋白水平，，結(jié)果提示：與上室細(xì)胞及總細(xì)中 CD24、Oct-4 及 ESA 在基因及蛋白水平存在明顯差異 P＜0
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：2625398