【摘要】：背景:腫瘤免疫治療是當(dāng)前腫瘤綜合治療中最具有前景的療法之一,.樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(professional antigen-presenting cell,APC),能夠激活初始T淋巴細(xì)胞(naive T cells),從而啟動特異性細(xì)胞免疫,在機(jī)體產(chǎn)生針對腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。既往研究證實,腫瘤細(xì)胞分泌多種免疫抑制因子,這些細(xì)胞因子能夠作用于體內(nèi)DC,干擾DC的正常發(fā)育和生理功能,構(gòu)成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。其中,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowthfactor,VEGF)能夠明顯抑制DC的分化成熟,且該抑制性作用通過DC表面的神經(jīng)纖毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)作為共受體介導(dǎo),NRP-1是一個很有前景的腫瘤治療靶點(diǎn)�；赩EGF/NRP-1相互作用的結(jié)構(gòu)關(guān)系,我們推測,可能存在一種多肽類NRP-1拮抗劑,能夠競爭性阻斷VEGF與DC表面NRP-1的特異性結(jié)合,逆轉(zhuǎn)VEGF對DC分化成熟的負(fù)向調(diào)控,進(jìn)而恢復(fù)DC在體內(nèi)外的免疫激活和調(diào)節(jié)等相關(guān)作用,增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的有效免疫應(yīng)答。目的:驗證新型多肽MY1340與DC表面NRP-1是否特異性結(jié)合;體外實驗明確MY1340能否拮抗VEGF對于DC成熟的抑制作用及相關(guān)機(jī)制;應(yīng)用荷瘤小鼠探究在體內(nèi)MY1340對脾臟中DC的影響及其對腫瘤生長的作用。方法:以健康成人外周血作為細(xì)胞來源,采用密度梯度離心結(jié)合磁珠分選從中提取單個核細(xì)胞,培養(yǎng)過程中添加IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)單核向DC進(jìn)行分化,使用LPS刺激DC成熟。通過形態(tài)學(xué)觀察以及流式細(xì)胞術(shù)檢測表型來驗證未成熟DC(immature DC,imDC)以及成熟 DC(matureDC,mDC)。采用Pull-down實驗結(jié)合液相二級質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定,并進(jìn)一步應(yīng)用Western blot驗證來綜合分析MY1340與DC表面的具體結(jié)合位點(diǎn);采用競爭性ELISA實驗確定MY1340是否能夠影響VEGF-NRP-1復(fù)合物的形成;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析MY1340對VEGF影響下DC表型和吞噬功能改變的作用;采用Luminex液相芯片檢測分析MY1340對VEGF作用下DC所分泌細(xì)胞因子變化的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MY1340對DC成熟相關(guān)通路信號分子磷酸化水平的影響以探索其作用機(jī)制。關(guān)于MY1340在體內(nèi)的效果,我們通過建立荷瘤小鼠模型,用流式細(xì)胞術(shù)檢測應(yīng)用MY1340后小鼠脾臟DC數(shù)量以及成熟程度的改變,記錄腫瘤生長以及小鼠的體重,觀察內(nèi)臟器官的形態(tài)變化以明確其體內(nèi)效果。結(jié)果:應(yīng)用密度梯度離心結(jié)合磁珠分選能夠從健康成人外周血中分離出高純度的單個核細(xì)胞,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察以及流式細(xì)胞術(shù)檢測能夠確定單核成功定向分化為imDC并在加入LPS刺激48小時后成熟。通過Pull-down結(jié)合LC-MS/MS以及Western blot驗證,我們證明了 MY1340與NRP-1的直接特異性結(jié)合;并通過競爭性ELISA實驗證明MY1340能夠抑制VEGF與NRP-1的結(jié)合;通過流式細(xì)胞術(shù)、吞噬實驗和Luminex細(xì)胞因子檢測,從DC的表型表達(dá)以及功能兩方面均驗證了 MY1340能夠桔抗VEGF對DC成熟的抑制作用;最后通過胞內(nèi)磷酸化的檢測,提示其促DC成熟可能是通過逆轉(zhuǎn)VEGF對ERK1/2和NF-κB磷酸化的抑制作用來實現(xiàn)的。荷瘤小鼠實驗證實:MY1340在體內(nèi)能夠抑制腫瘤的增長,流式檢測結(jié)果顯示MY1340能夠促進(jìn)小鼠脾臟DC的成熟。結(jié)論:新型多肽MY1340通過與NRP-1的特異性結(jié)合而抑制VEGF-NRP-1復(fù)合物的形成,通過拮抗VEGF對ERK1/2和NF-κB磷酸化抑制作用,逆轉(zhuǎn)VEGF對DC成熟的負(fù)向調(diào)控,并在荷瘤小鼠體內(nèi)促進(jìn)DC的成熟進(jìn)而起到抑瘤作用,有希望為腫瘤的免疫治療療效的提升以及DC疫苗的優(yōu)化提供新的思路。
【圖文】：

配體相結(jié)合，如血管內(nèi)皮生長因子（ＶＥＧＦ）、神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ，Ｓｅｍａ）、逡逑轉(zhuǎn)化生長因子ｐ邋（ＴＧＦ－ｐ）以及促吞噬素（Ｔｕｆｔｓｉｎ）等［１－３］。ＮＲＰ－１的胞內(nèi)區(qū)域較短，逡逑僅含４４個氨基釀不含激酶序列因而不能通過自身直接傳導(dǎo)信號［４，５］（圖１ＸＮＲＰ－逡逑１在胚胎發(fā)育時期的多種組織中有表達(dá)如神經(jīng)組織、腎臟、骨骼和背主動脈等，主要逡逑參與胚胎期動脈和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，在成體內(nèi)主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、Ｔ細(xì)胞、神經(jīng)逡逑內(nèi)分泌細(xì)胞等表面，參與體內(nèi)多種生理過程包括細(xì)胞遷移、血管生成以及免疫應(yīng)答等逡逑［６－９］。除了在正常組織細(xì)胞中表達(dá)外，，近年來研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞表面有ＮＲＰ－１表逡逑達(dá)，如骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，且ＮＲＰ－１在腫瘤中的高表達(dá)逡逑與腫瘤的侵襲性、臨床分級以及腫瘤分期通常呈正相關(guān)［１］。逡逑ＣｅｎｄＲ邐ＪＭＤ逡逑Ｎ邐Ｃ邋ｊａＥＳＢＥａｓＢｉＳＥＡ邋（Ｎｒ。＇逡逑ＳＥＭＡ３邋ｖｅＧＦ邐ｓｅｇｍｅｎｔ逡逑圖１神經(jīng)纖毛蛋白結(jié)構(gòu)示意圖［５］。逡逑樹突狀細(xì)胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ邋ｃｅｌｌｓ，邋ＤＣｓ）最早是由Ｒａｌｐｈ邋Ｓｔｅｉｎｍａｎ在１９７３年發(fā)現(xiàn)的一逡逑類專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠攝取、處理以及遞呈抗原，進(jìn)而激活Ｔ細(xì)胞啟動免疫應(yīng)逡逑答

１邋＿逡逑ｍ￡－邐■邋Ｓ！逡逑、單個核細(xì)逡逑「＾胞逡逑淋巴細(xì)胞逡逑－分離液逡逑煖~弤+ｓ逡逑■Ｉ靨紅細(xì)胞及逡逑＿粒細(xì)胞逡逑圖ｕ密度梯度離心法從人外周血濃縮白細(xì)胞分離獲取單個核細(xì)胞。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.51

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本文編號：2624987