發(fā)布時(shí)間：2020-04-09 23:05

【摘要】：第一部分宿主缺失CCL2或CCR2基因?qū)η傲邢侔┕寝D(zhuǎn)移的影響宿主骨微環(huán)境和前列腺癌細(xì)胞之間的相互作用增加骨髓微環(huán)境細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞表達(dá)和分泌一些重要細(xì)胞因子、趨化因子及粘附分子,促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。CCL2不僅由前列腺癌細(xì)胞分泌,而且骨微環(huán)境中的細(xì)胞也可大量產(chǎn)生。之前的研究主要探討腫瘤來源的CCL2對(duì)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的影響和機(jī)制,而對(duì)于宿主來源的CCL2或者CCR2在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的研究較少,且分子機(jī)制不清楚。本課題首先構(gòu)建了特異性前列腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型,為研究宿主來源的CCL2在其中的作用和分子機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。我們利用CCL2和CCR2敲除小鼠,通過左心室注射前列腺癌特異性骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞,實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況,研究CCL2/CCR2對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示宿主缺失CCL2基因能顯著減緩前列腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生,減慢腫瘤細(xì)胞在骨內(nèi)增殖速度,顯著延長小鼠的存活時(shí)間以及減小股骨的溶骨性損傷;而宿主缺失CCR2卻顯示增加前列腺癌骨轉(zhuǎn)移,縮短小鼠存活時(shí)間。第二部分宿主缺失CCL2減少前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制探討腫瘤細(xì)胞在骨髓中定植需要經(jīng)過多個(gè)步驟,包括血管的生成,局部侵襲和轉(zhuǎn)移,脫離原發(fā)灶進(jìn)入血管,然后從血管溢出,在骨髓中適應(yīng),存活和定植。腫瘤細(xì)胞來源的CCL2能夠結(jié)合CCR2促進(jìn)腫瘤增殖和血管生成,以及招募間質(zhì)細(xì)胞利于腫瘤轉(zhuǎn)移。本課題主要研究宿主來源的CCL2在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用,試圖從不同方面闡述其對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制�；谇捌跇�(gòu)建的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型,我們首先將WT鼠或CCL2 KO鼠中分離出的骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞,以及親本細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq;其次,比較來源于CCL2 KO鼠和WT鼠的骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞表達(dá)差異,找到與宿主CCL2相關(guān)的基因改變以及通路改變,試圖找到一條信號(hào)通路闡明CCL2 KO抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制;再次,通過流式細(xì)胞儀檢測骨微環(huán)境中MDSC的數(shù)量變化;最后,在體內(nèi)和體外,觀察宿主來源的CCL2引起的骨吸收和骨形成的變化機(jī)制。結(jié)果顯示:(1)我們鑒定了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生物行為學(xué)特性;(2)通過分析CCL2 KO鼠和WT鼠的骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞表達(dá)差異,經(jīng)過聚類分析和KEGG通路富集,我們鑒定了細(xì)胞周期蛋白CCND2與CCL2的關(guān)系,定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(Quantitative real-time-PCR,qRT-PCR)也證實(shí)了CCL2 KO鼠分離的骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞CCND2基因明顯比WT鼠的表達(dá)低,CCL2 KO鼠分離的骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞相較與親本細(xì)胞增殖能力也降低;(3)宿主缺失CCL2基因減少了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中MDSC的產(chǎn)生,也減少了前列腺癌的溶骨性損傷,包括減少股骨TRAP陽性細(xì)胞數(shù)和PCNA陽性細(xì)胞數(shù),增加骨密度等;(4)體外證實(shí)了腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理敲除CCL2基因的破骨細(xì)胞分化能力減弱,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的分化標(biāo)志物NFATc1的表達(dá)也顯著降低。第三部分前列腺癌潛在轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的篩選前列腺癌在美國是男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。大多數(shù)前列腺癌確診時(shí)已是腫瘤晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移。骨骼是前列腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位,骨轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致高死亡率的最主要原因。本部分我們通過兩種方法篩選前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物。首先,將親本細(xì)胞和骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq,通過差異基因篩選富集分析,找到可能引起特異性前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。其次,使用Oncomine,cBioPortal和TCGA公共數(shù)據(jù)庫篩選前列腺癌與癌旁組織的差異基因,并調(diào)查差異基因與臨床病理參數(shù)之間潛在的相關(guān)性并用于估計(jì)疾病的進(jìn)程和預(yù)后。我們發(fā)現(xiàn)C10orf116拷貝數(shù)缺失有助于我們?cè)u(píng)估PCa侵襲轉(zhuǎn)移能力和判斷預(yù)后。結(jié)論1.宿主缺失CCL2能減緩前列腺癌細(xì)胞在骨內(nèi)的生長,而宿主缺失CCR2卻顯示增加前列腺癌骨轉(zhuǎn)移,縮短小鼠存活時(shí)間。2.宿主缺失CCL2基因可通過抑制MDSC細(xì)胞招募到腫瘤微環(huán)境,從而促進(jìn)免疫應(yīng)答來抑制腫瘤細(xì)胞在骨內(nèi)的生長和定植。3.宿主缺失CCL2基因引起破骨細(xì)胞分化障礙,從而抑制前列腺癌的溶骨性損傷。4.通過分析RNA-Seq數(shù)據(jù),我們篩選出一些可能與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物并進(jìn)行了初步鑒定,后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)尚在進(jìn)行中。5.通過挖掘公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)C10orf116拷貝數(shù)缺失可作為一個(gè)預(yù)測指標(biāo),有助于評(píng)估前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力和判斷預(yù)后。
【圖文】：

的 CCL2 調(diào)控前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制及潛在轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的篩選 2018 屆博士學(xué)察特異性骨轉(zhuǎn)移的情況，也不能深入研究腫瘤細(xì)胞與免疫系作用，誘導(dǎo)周期較長，每周需要注射不同的CCL2 中和抗體成本高。CCR2 與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的研究報(bào)道不多，而宿主R2 對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的研究報(bào)道更少。本課題采用具有免7BL/6J小鼠，，采用左心室注射RM1 細(xì)胞，模擬了臨床上前胞從血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到骨的過程，通過從骨髓分離腫瘤細(xì)胞再式獲得靶向骨特異性的前列腺癌細(xì)胞（RM1-BM）。為后續(xù)腺癌特異性骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

的 CCL2 調(diào)控前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制及潛在轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的篩選 2018 屆博士溶液和 75％酒精對(duì)其胸腹部仔細(xì)消毒，重復(fù)兩次； 找好體表標(biāo)志，左心室位于胸骨和劍突連線中點(diǎn)稍偏四肋間隙內(nèi)（如圖 1-2 所示），隨后用胰島素針注射入 2細(xì)胞懸液（1×105個(gè)細(xì)胞，RM1-BM2），回抽血液呈鮮 將小鼠移至復(fù)溫?zé)粝抡丈鋷椭∈蠡謴?fù)體溫，直至其 重復(fù)以上操作。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25

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