【摘要】：第一部分PANC-1及HPDE6-C7細胞系外泌體的分離鑒定及特征性因子的檢測本部分實驗采用常規(guī)培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)胰腺癌細胞系PANC-1和正常細胞系HPDE6-C7。外泌體分離采用超高速密度梯度離心法。分離得到的外泌體于透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)下進行粒徑和大小的觀察。外泌體計數(shù)采用納米分子追蹤分析(Nanosight Tracking Analysis,NTA)技術,經(jīng)計算五次實驗得到均值作為其最終濃度。外泌體表面分子的鑒定采用磁珠捕獲結合流式分析法和流式納米分析法,蛋白定量采用BCA法,ZETA電位經(jīng)Zetasizer Nano儀器測得。經(jīng)實驗,透射電鏡結果顯示,PANC-1與HPDE6-C7細胞系來源的外泌體(以下簡稱EXO-PANC1,EXO-HPDE6-C7)直徑在30-180nm之間;NTA分析得到EXO-PANC1溶液的濃度為2.72*10~(10)±2.05*10~9個/ml,EXO-HPDE6-C7溶液的濃度為2.43*10~(10)±2.21*10~9個/ml;BCA法測定EXO-PANC1溶液的蛋白濃度為111.31μg/ml,EXO-HPDE6-C7溶液為109.89μg/ml;Zeta電位分析得到EXO-HPDE6-C7的ZETA電位為-25.4mV,EXO-PANC1為-10.1 mV。磁珠結合流式分析結果顯示,CD9,CD63不能顯著地將EXO-PANC1與EXO-HPDE6-C7區(qū)別開,而磷脂酰肌醇聚糖-1(Glypican-1,GPC-1)和巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)可明顯將兩者區(qū)別開來,流式納米分析結果顯示EXO-PANC1表面高表達MIF與GPC1抗原。本部分結果證明PANC-1與HPDE6-C7得到的外泌體符合目前文獻規(guī)定的相關特性(粒徑大小,CD9,CD63分子的表達),在胰腺癌細胞系來源的外泌體中高標達的GPC1與MIF分子可作為后續(xù)實驗檢測的靶向分子。第二部分包被抗體的多巴胺芯片及SERS探針相關制備條件的摸索本部分實驗中我們初步擬定了多巴胺芯片的制備步驟并探討了多巴胺溶液濃度對芯片合成效果的影響。對用于表面增強拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,SERS)技術檢測的納米探針的合成,我們首先采用經(jīng)典途徑合成18nm AuNPs作為核心,進而逐漸形成Au@Ag@pATP材料結構。為了保護較為脆弱的銀層,我們在銀表面添加了一層保護性牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)。為將檢測抗體連接到納米顆粒表面同時不影響其穩(wěn)定性和生物相容性,我們利用多巴胺的聚合作用將抗體黏附到納米顆粒表面,從而形成了多層包被的納米球SERS探針結構。我們對SERS探針的TEM鏡下成像、紫外光譜、SERS光譜等特性進行了鑒定,并對探針合成過程中關鍵性影響因子-AgNO3溶液濃度及pATP溶液濃度進行了摸索。經(jīng)實驗,我們得知在多巴胺溶液濃度為33mM時芯片合成聚合效果最佳。SERS探針合成過程中AgNO3溶液為0.096mM,pATP溶液為9.6mM時效果最佳。TEM電鏡下觀察到Ag層的厚度為1nm左右,多巴胺為3nm左右,紫外可見吸收光譜觀察到金納米顆粒僅有一個吸收峰(521nm),而SERS探針有兩個吸收峰(400nm與500nm),分別來源于銀與金納米顆粒。拉曼光譜顯示SERS探針有較強的拉曼信號峰(1072-1076cm~(-1))。在低功率(0.05mW)和短掃描時間(10ms)的條件下,拉曼信號依舊可以獲得。經(jīng)本部分實驗摸索得到的上述多巴胺芯片-SERS體系的優(yōu)化條件將用于進一步實驗體系的建立。第三部分多巴胺芯片-SERS檢測系統(tǒng)用于細胞系外泌體的檢測及其體系優(yōu)化本部分實驗我們分別以不同抗原為靶點,利用前期建立的多巴胺芯片-SERS體系對EXO-PANC1與EXO-HPDE6-C7進行了檢測。結果表明以GPC1或MIF為靶點的多巴胺芯片-SERS檢測體系能夠?qū)XO-PANC1與EXO-HPDE6-C7進行區(qū)分,以CD9,CD63為檢測位點不能有效地將兩者區(qū)分。我們進一步加入表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR),對分別以MIF,GPC1,EGFR,CD63這四種抗原為靶點的多巴胺芯片-SERS體系的檢測效能進行了評價,發(fā)現(xiàn)MIF/GPC1/EGFR組具有相同的最低檢測限(9.0*10~(-19)mol//L),而CD63組不能檢測到該最低濃度下的外泌體。從各組得到的線性方程式來看,MIF組線性方程式的斜率最高,證明其檢測靈敏度更高。接下來,我們以MIF為檢測靶點對EXO-PANC1進行了檢測,并對其進行了標準曲線繪制,低濃度外泌體溶液條件下的線性擬合方程公式為y=-2.4152+1.2392x。該體系可檢測到2μl濃度為5.44*10~2個/ml外泌體溶液中的EXO-PANC1,相比較于商業(yè)化ELISA試劑盒靈敏度大大提高。本部分結果顯示以MIF為靶點的多巴胺芯片-SERS檢測體系其診斷效能遠高于其他體系,可用于后續(xù)臨床標本的測定。第四部分多巴胺芯片-SERS檢測系統(tǒng)用于胰腺癌患者血清標本的檢測及檢測效能的評價本部分實驗中我們首先以MIF/GPC1/EGFR為靶點利用多巴胺芯片-SERS體系對胰腺癌患者和健康人血清標本進行了檢測,結果表明僅MIF-SERS體系能夠?qū)⒁认侔┗颊吲c正常人、胰腺癌患者P1~2與P3期、胰腺癌患者轉移與未轉移組進行區(qū)分(P0.05)。我們進一步將MIF-SERS體系檢測結果與臨床檢測指標癌抗原(cancer antigen 19-9,CA19-9),癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)及MIF-ELISA商品化試劑盒檢測結果進行了比較,發(fā)現(xiàn)CA199能夠?qū)⒁认侔┗颊吲c健康人區(qū)別開(P0.05),但不能將胰腺癌患者P1~2與P3期、轉移與未轉移組進行區(qū)分(P0.05),其與MIF-SERS體系有相似的靈敏度(68.2%vs 62.5%)與特異性(72.7%vs 76.2%)。對CEA的結果分析顯示,該指標不能將上述三組進行區(qū)分(P0.05),其靈敏度較MIF-SERS體系降低了21.6%,特異性降低了12.6%。ELISA法的靈敏度與特異性相比較于MIF-SERS體系分別降低了21.6%,16.2%。此外,與上述經(jīng)典方法比較,MIF-SERS體系的血清用量大大減少(1-2mL vs 2μL)。根據(jù)標本檢測值我們初步制定以MIF為靶點的log(拉曼信號)的臨床參考值范圍為胰腺癌vs正常:3.77±0.15 vs 2.67±0.80,cutoff值為3.55,拉曼信號成像點的掃描信號強度閾值為20。接下來,我們用統(tǒng)計學方法對MIF,GPC1,EGFR三組的檢測結果進行了聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷的靈敏度較單獨的MIF-SERS體系提高了12.5%,特異性與MIF-SERS體系相當(75.0%vs 76.2%),經(jīng)計算其cutoff值(胰腺癌患者vs健康人)為0.27。通過本部分實驗,我們基本上構建了以MIF為靶點的多巴胺芯片-SERS檢測體系,該體系結合GPC1,EGFR等檢測指標,有希望應用于臨床檢測與胰腺癌的輔助診斷。
【圖文】：

文氮中永久保存。復蘇細胞時將凍存細胞液于n 后去除凍存液，用培養(yǎng)液重懸后按上述培分離養(yǎng)至最佳生長狀態(tài)，胎牛血清于 120000g，4成含 10%FBS 的培養(yǎng)基，以此培養(yǎng)基培養(yǎng)細取。外泌體分離方法如下：將培養(yǎng)基于低轉，，收集上清并經(jīng) 0.22μm 過濾器過濾，于 12沉淀以 PBS 洗兩次，重懸得到外泌體溶液

- 18 -圖 2. Exo-HPDE6-C7 與 Exo-PANC-1 的特性鑒定. (a) Exo-HPDE6-C7 和(b)Exo-PANC-1 的TEM 圖; (c) BCA 法測定外泌體溶液蛋白含量的標準曲線及計算公式，A562 即在 562nm 激光下測得的吸光度值；(d) Exo-HPDE6-C7 和(e)Exo-PANC-1 的粒徑分布圖; (f) Exo-HPDE6-C7 和 Exo-PANC-1 的 ZETA 電位。(二) 磁珠結合流式用于外泌體表面分子的鑒定結果1.檢測原理：如圖 3 所示，SM3-P100 磁珠經(jīng)活化后其表面有各種活性功能基團（例如羧基、氨基等），這些基團在一定條件下可結合具有生物活性的抗體蛋白例如 anti-MIF，進而識別并捕獲待測樣本中表達 MIF 的外泌體。由于該磁珠粒徑在納米級別，故其處于順磁狀態(tài)，在外磁場中能被磁鐵牢牢吸附從而快速分離捕獲的外泌
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9;R730.43

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