【摘要】：腫瘤抑制基因p53在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用。作為突變頻率最高的抑癌基因之一,p53在50%以上的人類腫瘤中發(fā)生突變,并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)維持較高水平。Rap2b是Ras癌基因超家族和p53的新靶基因,在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。我們推測,腫瘤細(xì)胞中較高水平的突變p53蛋白仍在一定程度上保留了對(duì)Rap2b的誘導(dǎo)能力,因而表達(dá)較高水平的Rap2b,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。本研究旨在探討Rap2b在p53突變的腫瘤細(xì)胞中的功能、Rap2b表達(dá)水平與p53突變之間的關(guān)系及其可能的分子基礎(chǔ),為深入理解Rap2b和p53在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。首先,本研究參照UMD數(shù)據(jù)庫中各種腫瘤的p53熱點(diǎn)突變資料,選擇46個(gè)突變位點(diǎn)和突變方式,設(shè)計(jì)一系列p53突變引物構(gòu)建p53突變體,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至HCT116(p53-/-)細(xì)胞,并利用免疫印跡法檢測突變體的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,31個(gè)p53突變體在該細(xì)胞中存在高水平表達(dá)。接著,選取能成功表達(dá)p53突變體的質(zhì)粒包裝慢病毒,感染人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116(p53-/-),經(jīng)抗生素篩選后,獲得穩(wěn)定表達(dá)各種p53突變體的細(xì)胞株。利用免疫印跡法檢測Rap2b和p53的表達(dá)水平,以揭示不同p53突變體與Rap2b表達(dá)水平之間的關(guān)系。結(jié)果表明,p53某些位點(diǎn)的突變能提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)Rap2b的蛋白水平。然后,選取兩個(gè)代表性的p53突變(p53R175H和p53R273H)細(xì)胞株,穩(wěn)定敲低細(xì)胞內(nèi)Rap2b的表達(dá)水平,觀察Rap2b的敲低對(duì)p53突變腫瘤細(xì)胞株生長速率、遷移能力、致瘤性、阿霉素處理前后細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,Rap2b敲低后p53突變腫瘤細(xì)胞的生長速率、致瘤性和細(xì)胞遷移能力顯著降低,但是對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期沒有明顯影響。最后,為探明p53突變腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平Rap2b蛋白的原因,我們研究了在p53野生型和突變型腫瘤細(xì)胞中調(diào)控Rap2b表達(dá)方式的差異。通過用Nutlin-3處理p53野生型及突變型腫瘤細(xì)胞,并在撤除Nutlin-3后的不同時(shí)間點(diǎn)用免疫印跡法檢測p53和Rap2b的蛋白水平,我們發(fā)現(xiàn)在p53突變的腫瘤細(xì)胞中,p53突變體蛋白在Nutlin-3撤除后仍在較長時(shí)間范圍內(nèi)維持較高水平,并且p53在不同程度上丟失了對(duì)某些靶基因如p21的誘導(dǎo)作用,但仍然能誘導(dǎo)一些靶基因如Rap2b、Hdm2、Bax和Puma等的表達(dá)。我們還通過Pulldown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),p53的突變嚴(yán)重阻礙p53與Rap2b的直接結(jié)合。綜上所述,本研究揭示p53突變通過顯著提升腫瘤細(xì)胞中p53突變體蛋白的穩(wěn)定性,使腫瘤細(xì)胞中的Rap2b蛋白維持在較高水平,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于制定有效的人類癌癥治療策略具有重要意義。
【圖文】：

超過９５％的錯(cuò)義突變發(fā)生在ＤＢＤ區(qū)，盡管該區(qū)域的每個(gè)氨基酸都能發(fā)生突變，但是逡逑以下幾個(gè)位點(diǎn)的突變?cè)诎┌Y中則相對(duì)頻繁，并與癌癥發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)，因而被稱之為熱點(diǎn)逡逑突變，這幾個(gè)突變位點(diǎn)分別是：Ｒ１７５、Ｇ２４５、Ｒ２４８、Ｒ２４９、Ｒ２７３、Ｒ２８２邋（圖１－１）。逡逑ｐ５３突變大體上可以分為兩種：移除了基本的ＤＮＡ作用位點(diǎn)的ＤＮＡ接觸突變（致使ｐ５３逡逑與ＤＮＡ結(jié)合的能力減弱）和擾亂了邋ｐ５３功能域的結(jié)構(gòu)突變，最終減弱了它的動(dòng)力學(xué)和熱逡逑力學(xué)穩(wěn)定性（Ｃｈｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９４；邋Ｆｒｉｅｄｌｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３）。逡逑１．２．２突變ｐ５３特性逡逑１．２．２．１突變ｐ５３的半衰其月逡逑突變ｐ５３為了執(zhí)行其功能，在癌細(xì)胞中的高水平表達(dá)是其功能性獲得的重要一步，其逡逑半衰期也得到普遍的延長（１－２４ｈ），而野生型ｐ５３蛋白的半衰期則被嚴(yán)格控制，通常只有１０逡逑ｍｉｎ左右。對(duì)于這一現(xiàn)象，有研宄發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞中ｐ５３突變蛋白在細(xì)胞中的定位更加廣泛逡逑（Ｓｏｕｓｓｉ，邋２００５；邋Ｍｏｒｓｅｌｌｉ邋ｅｔａｌ．，邋２００８），這表明ｐ５３突變蛋白在核質(zhì)間的穿梭能力降低，使ｐ５３逡逑突變蛋白被ＨＤＭ２泛素化修飾并降解的機(jī)會(huì)降低。另有研究表明，在ｐ５３突變的細(xì)胞中，逡逑ｐ５３與ＨＤＭ２／ＭＤＭ２這一負(fù)反饋機(jī)制受到限制（Ｙｕｅｅｔａｌ．

（Ｍａｒｉｄｏｎｎｅａｕ邋ａｎｄ邋Ｄｅ，邋１９９２），多個(gè)研究均己證明Ｒａｐ２ｂ在細(xì)胞癌變時(shí)表達(dá)量增加（Ｄｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１５；邋Ｚｈａｎｇ邋ｅｔａｌ．，邋２００７），進(jìn)而推定該蛋白可能加速細(xì)胞致瘤并是一個(gè)癌基因。另外，最逡逑新的ＧＥＰ丨Ａ數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Ｒａｐ２ｂ在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)（圖１－４）。逡逑３0邋１逡逑＾２５邋■邐■ＴＵｍ0ｒ逡逑■邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑ｍ逡逑Ｚ邋２０邋－逡逑ｌ１５邐Ｉ逡逑圖１－４邋Ｒａｐ２ｂ在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。數(shù)據(jù)來自最新ＧＥＰＩＡ數(shù)據(jù)庫。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｒａｐ２ｂ邋ｉｓ邋ｈｉｇｈｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｉｎ邋ａ邋ｖａｒｉｅｔｙ邋ｏｆ邋ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ｃｏｍｅ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｌａｔｅｓｔ邋ＧＥＰＩＡ逡逑ｄａｔａｂａｓｅ．逡逑Ｒａｐ２ｂ作為一個(gè)�。牵裕校幔螅�，，在鳥苷酸交換因子（ＧＥＦ）作用下（ＧｕｉｄｅｔｔｉａｎｄＴｏｒｔｉ，逡逑２０１２），１＾卩２１？通過結(jié)合0丁？而激活，而在0丁？＆５６激活蛋白（0八？）作用下（0代（；（＾１３１．，逡逑２００６），邋Ｒａｐ２ｂ邋結(jié)合邋ＧＤＰ邋而失活。ＧＥＦ邋主要包括邋ＰＤＺ－ＧＥＦｓ、Ｅｐａｃｌ、ＣａｌＤＡＧ－ＧＥＦ、逡逑Ｃｒｋ、Ｃ３Ｇ等，ＧＡＰ主要包括ＲａｐＧＡＰ、Ｅ６ＴＰ１、ＳＩＰＡ１。在許多胞外激活劑及胞內(nèi)信號(hào)逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.2

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1 楊京舉;;細(xì)胞癌變拾遺[J];中學(xué)生物教學(xué);2012年Z1期

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3 張建明,柯楊;細(xì)胞癌變的遺傳模型研究回顧與展望[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);1997年01期

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6 李桂源;潘世[

本文編號(hào)：2611482