發(fā)布時(shí)間：2020-04-01 21:52

【摘要】：惡性腫瘤對(duì)人類的健康和生命產(chǎn)生了巨大威脅,是中國乃至全世界主要的人口死亡原因之一。根據(jù)我國最新癌癥統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù),肺癌是當(dāng)今中國死亡率最高的惡性腫瘤,晚期肺癌五年生存率不足15%。根據(jù)病理類型,肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell Lung Cancer,NSCLC)及小細(xì)胞肺癌(Small-cell Lung Cancer,SCLC),其中NSCLC是肺癌的主要組成部分,占肺癌總數(shù)的80-85%。由于缺乏典型的臨床表現(xiàn),NSCLC在診斷初期往往已經(jīng)是晚期。近年來,盡管NSCLC的治療在手術(shù)、放療及化療中都取得了一定的進(jìn)展,但五年生存率仍較低。乏氧是惡性實(shí)體瘤的重要生物學(xué)特性之一。近二十年來的臨床研究已經(jīng)明確證實(shí)幾乎所有惡性實(shí)體瘤中都存在一定范圍的乏氧區(qū)域,是局部晚期實(shí)體瘤的特征性病理生理特征之一。乏氧在腫瘤中產(chǎn)生的原因是多樣化的,但其根源在于氧氣供給不足以及耗氧量增加。在正常組織中,氧氣的供給與組織代謝的需求處于平衡狀態(tài),但在惡性腫瘤中,由于沒有完善的血供以及腫瘤的高代謝狀態(tài),最終導(dǎo)致了腫瘤乏氧。同時(shí),由于腫瘤本身以及化療相關(guān)性貧血,進(jìn)一步使血液中氧含量下降以及腫瘤供氧不足。乏氧會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生巨大影響,比如會(huì)提高腫瘤基因組不穩(wěn)定性、促進(jìn)腫瘤血管生成、引起腫瘤轉(zhuǎn)移、導(dǎo)致放化療耐受以及產(chǎn)生不良預(yù)后等。與乏氧相對(duì)應(yīng)的則是氧化應(yīng)激,但二者之間并不矛盾。氧氣是線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate,ATP)所必須的,同時(shí),由于氧氣分子活潑的化學(xué)活性,極易形成活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)。當(dāng)細(xì)胞處于乏氧狀態(tài)時(shí),由于能量及氧氣缺乏,線粒體復(fù)合體III中ROS產(chǎn)生急劇增加。ROS是細(xì)胞代謝中的正常產(chǎn)物,主要包括超氧化物、過氧化物和氫氧自由基等。線粒體代謝過程中電子傳遞鏈?zhǔn)荝OS的主要來源。ROS在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,在正常組織中,細(xì)胞內(nèi)ROS水平通過氧化還原機(jī)制控制在平衡狀態(tài),而腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。一定水平的ROS會(huì)增加腫瘤細(xì)胞突變頻率,激活增殖相關(guān)信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。盡管ROS在一定程度上促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但當(dāng)ROS水平過高時(shí),則會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生致命性損傷,從而成為腫瘤治療的靶點(diǎn)之一。氧化還原水平的平衡取決于ROS的產(chǎn)生速率與清除系統(tǒng)的清除能力。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、硫氧還蛋白、谷氧還蛋白等多種ROS清除劑在氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在前期關(guān)于乏氧的研究中,我們發(fā)現(xiàn)乏氧誘導(dǎo)因子-1的表達(dá)與肝激酶B1(Liver Kinase B1,LKB1)信號(hào)通路密切相關(guān)。LKB1是細(xì)胞內(nèi)維持能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子,LKB1單獨(dú)突變被認(rèn)為不能誘導(dǎo)肺癌的出現(xiàn),但KRAS-LKB1共突變(KL腫瘤)則會(huì)誘導(dǎo)肺腺癌、鱗癌或大細(xì)胞癌。在關(guān)于KRAS腫瘤的研究中,曾有學(xué)者提出將KRAS腫瘤根據(jù)共突變類型分成三個(gè)亞類,KRAS-LKB1共突變是其中重要的一種亞型。KL腫瘤比KRAS突變腫瘤(K腫瘤)生長更快,更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,而KL腫瘤通常合并有KEAP1的共突變。KEAP1是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要分子,作為E3泛素連接酶的適配蛋白,正常情況下KEAP1在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合到NRF2上并誘導(dǎo)其泛素化,通過蛋白酶體途徑降解NRF2,進(jìn)而影響抗氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,其中最重要的是谷氨酰胺代謝相關(guān)通路基因表達(dá)的改變。我們研究發(fā)現(xiàn)LKB1突變腫瘤抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng),這可能與LKB1突變合并KEAP1突變或NRF2上調(diào)進(jìn)而引起谷氨酰胺代謝增強(qiáng)密切相關(guān)。谷氨酰胺的代謝在腫瘤的進(jìn)展過程中非常關(guān)鍵,其重要性主要體現(xiàn)在其與葡萄糖一樣,能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長提供大量的ATP,并且是生成細(xì)胞內(nèi)主要還原產(chǎn)物GSH的前體氨基酸。正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞均需利用葡萄糖及谷氨酰胺,但需求量存在很大差別。腫瘤細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的需求遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)催化作用下形成谷氨酸是谷氨酰胺代謝的首要步驟。目前,GLS抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床I期實(shí)驗(yàn),但并非對(duì)所有患者均有效,尋找合適的生物標(biāo)記物指導(dǎo)GLS抑制劑的臨床應(yīng)用,對(duì)該藥在臨床上的廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。目前GLS抑制劑的作用機(jī)制仍不清楚。根據(jù)谷氨酰胺在細(xì)胞中的作用,我們推測GLS抑制劑能夠誘導(dǎo)能量應(yīng)激及氧化應(yīng)激,進(jìn)而起到抗腫瘤作用。鑒于LKB1在腫瘤細(xì)胞中維持能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)中的重要作用,我們進(jìn)一步探索了LKB1及其他突變對(duì)GLS抑制劑抗腫瘤作用的影響。第一部分 紅細(xì)胞相關(guān)指數(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響的研究[研究目的]1.以乏氧誘因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn),分析NSCLC患者術(shù)前紅細(xì)胞相關(guān)指數(shù)對(duì)患者預(yù)后的影響;2.通過多因素分析,尋找紅細(xì)胞相關(guān)指數(shù)中潛在的NSCLC獨(dú)立預(yù)后因子;3.探索該指標(biāo)與NSCLC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。[研究方法]1.入組患者:本研究選取了從2006年1月到2009年12月在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科行肺癌根治術(shù)的患者,根據(jù)入組條件篩選患者入組。2.資料收集:收集患者的姓名、性別、血常規(guī)檢查(入院后首次檢查結(jié)果為準(zhǔn))、吸煙史、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、術(shù)式等信息。通過山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院病案管理系統(tǒng)獲取患者臨床信息及聯(lián)系方式。通過電話回訪的方式進(jìn)行隨訪。3.統(tǒng)計(jì)方法:研究首要終點(diǎn)為患者總生存期(Overall Survival,OS),次要研究終點(diǎn)為無進(jìn)展生存期(Recurrence Free Survival,RFS)。Kaplan-Meier法分析單因素對(duì)患者預(yù)后的影響并繪制生存曲線。通過log-rank時(shí)序檢驗(yàn)比較兩組之間的差異。通過受試者工作特征曲線比較不同指標(biāo)對(duì)預(yù)后的預(yù)測能力并確定最佳界值。通過χ2檢驗(yàn)(必要時(shí)使用Fisher確切檢驗(yàn))或t檢驗(yàn)分析紅細(xì)胞相關(guān)指數(shù)與臨床病理特征之間的關(guān)系。預(yù)后因子的多因素分析通過Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行。單因素分析中p0.05的變量進(jìn)入多因素分析。當(dāng)p0.05時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(雙側(cè)檢驗(yàn))。[研究結(jié)果]1.患者基本特征:本研究共納入患者649例,男性患者456例,女性患者193例。在患者的病理分期分布中,早期患者居多,Ⅰ/Ⅱ期患者占研究總?cè)藬?shù)的72.9%,Ⅲ期患者占27.1%,無Ⅳ期患者入組;2.單因素分析:患者的性別、年齡、術(shù)式、腫瘤分化程度、N分期、T分期、腫瘤大小、血紅蛋白(Hemoglobin,HGB)、紅細(xì)胞壓積(Hematocrit,HCT)、平均紅細(xì)胞體積(Mean Corpuscular Volume,MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MeanCorpuscularHemoglobin,MCH)以及平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(Mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)與患者預(yù)后相關(guān)。紅細(xì)胞相關(guān)指數(shù)中,較高水平的HGB、HCT、MCHC、MCV以及MCH與NSCLC患者較好的OS相關(guān)。同時(shí),在對(duì)RFS的研究中,較高水平的MCH、MCV以及MCHC與較好的RFS也密切相關(guān),但HGB與HCT對(duì)RFS影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3.多因素分析:在利用其它明確預(yù)后因子校正后,只有MCHC既是OS的獨(dú)立預(yù)后因子(p=0.032),又是RFS的獨(dú)立預(yù)后因子(p=0.010)。MCV僅僅是OS的獨(dú)立預(yù)后因子(p=0.018),但不是RFS的獨(dú)立預(yù)后因子(p=0.059)。其它紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo),如HCT、HGB以及MCH等僅在單因素分析中有意義,但在多因素分析中沒有意義,證明這些預(yù)后因子并非獨(dú)立預(yù)后因子;4.MCHC與臨床病理因素的相關(guān)性分析:低MCHC水平與男性(p=0.02)、較高吸煙指數(shù)(p=0.002)、較高T分期(p=0.018)以及較大腫瘤體積(p=0.004)密切相關(guān)。[研究結(jié)論]1.單因素分析中,MCHC、MCH及MCV均對(duì)NSCLC患者OS及RFS有影響,但HGB、HCT僅影響患者OS;2.在非貧血NSCLC患者中,MCHC是預(yù)測OS及RFS的獨(dú)立預(yù)后因子,MCV是預(yù)測OS的獨(dú)立預(yù)后因子,但不是預(yù)測RFS的獨(dú)立預(yù)后因子;3.低MCHC水平與男性、較高吸煙指數(shù)、較高T分期以及較大腫瘤體積密切相關(guān)。第二部分 能量及氧化應(yīng)激對(duì)KRAS突變NSCLC治療作用研究[研究目的]1.LKB1與KEAP1/NRF2在維持細(xì)胞內(nèi)能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)中的作用;2.KEAP1/NRF2通路在LKB1缺失NSCLC中對(duì)能量及氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用;3.LKB1及KEAP1/NRF2對(duì)谷氨酰胺代謝的調(diào)控及各突變類型細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的依賴性;4.GLS抑制劑對(duì)NSCLC治療作用;5.LKB1及KEAP1/NRF2通路對(duì)GLS抑制劑抗腫瘤作用的影響。[研究方法]1.利用腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)對(duì)KRAS突變NSCLC進(jìn)行共突變分析,利用基因富集分析(Geneset Enrichment Analysis,GSEA)研究KEAP1突變對(duì)NSCLC可能的影響;2.利用慢病毒感染或CRISPR/cas9構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)或敲除細(xì)胞系(LKB1及KEAP1過表達(dá)和KEAP1敲除),利用siRNA敲除NRF2;3.利用磺酰羅丹明B細(xì)胞染色法、克隆形成實(shí)驗(yàn)及CellTiter-Glo檢測細(xì)胞增殖或細(xì)胞活力,利用BrdU及PI法檢測細(xì)胞周期,利用AnnexinV/7-AAD檢測細(xì)胞凋亡,利用DCFDA檢測細(xì)胞ROS水平,利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測蛋白表達(dá),利用ATPlite檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平,利用相應(yīng)試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)各種代謝產(chǎn)物含量,利用2-NBDG檢測細(xì)胞葡萄糖攝取水平。[研究結(jié)果]1.共突變分析顯示,在NSCLC中,KRAS與LKB1及LKB1與KEAP1之間存在明顯共突變;2.LKB1能夠維持腫瘤細(xì)胞能量及氧化還原穩(wěn)態(tài),LKB1缺失細(xì)胞對(duì)能量應(yīng)激敏感但對(duì)氧化應(yīng)激耐受;3.LKB1可以通過KEAP1非依賴性途徑調(diào)控NRF2的表達(dá);4.LKB1及KEAP1共同調(diào)控谷氨酰胺代謝及細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的依賴性;5.GLS抑制劑CB-839及IACS-006274具有良好的抗腫瘤活性,能夠通過周期抑制引起腫瘤細(xì)胞增殖抑制,但不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;6.GLS抑制劑能夠誘導(dǎo)腫瘤氧化應(yīng)激及能量應(yīng)激,且其腫瘤抑制作用能被丙酮酸及還原劑所挽救;7.GLS抑制劑可以完全抑制KRAS-LKB1-KEAP1腫瘤細(xì)胞的增殖,部分抑制KRAS-LKB1突變或KRAS-KEAP1突變腫瘤細(xì)胞的增殖,但幾乎不能抑制KRAS單獨(dú)突變腫瘤細(xì)胞的增殖。[研究結(jié)論]1.LKB1突變腫瘤能夠通過KEAP1突變或KEAP1非依賴途徑誘導(dǎo)上調(diào)NRF2的表達(dá),并產(chǎn)生對(duì)谷氨酰胺的依賴;2.GLS抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用是通過誘導(dǎo)能量及氧化應(yīng)激作用而產(chǎn)生的;3.GLS抑制劑對(duì)KRAS-LKB1-KEAP1共突變腫瘤效果最好,可能成為GLS抑制劑臨床用藥的生物標(biāo)記物。
【圖文】：

能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長提供大量的ＡＴＰ，并且為大分子產(chǎn)物的合成提供中逡逑間產(chǎn)物［７２］。正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞均需利用葡萄糖及谷氨酰胺，但需求量存在很大逡逑差別，如圖２所示，正常細(xì)胞利用葡萄糖通過氧化磷酸化作用生成ＡＴＰ及其他代逡逑謝產(chǎn)物，而腫瘤細(xì)胞通常利用糖酵解產(chǎn)生ＡＴＰ，，產(chǎn)能效率低，但產(chǎn)能速度快，因而逡逑對(duì)葡萄糖的需求量大于正常組織；而對(duì)于谷氨酰胺，正常細(xì)胞利用谷氨憸胺的量較逡逑少，而腫瘤細(xì)胞由于葡萄糖產(chǎn)能低而且細(xì)胞內(nèi)ＲＯＳ水平高，對(duì)谷氨酰胺的利用量逡逑遠(yuǎn)高于正常組織［７３］。逡逑谷氨酰胺的代謝過程如圖３所示，谷氨酰胺通過ＡＳＣＴ２進(jìn)入細(xì)胞后，部分谷逡逑氨酰胺進(jìn)入線粒體，在線粒體中谷氨酰胺酶（Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，邋ＧＬＳ）作用下形成谷氨逡逑酸，部分谷氨酸會(huì)被從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)出去用于ＧＳＨ的合成，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原逡逑平衡，而另一部分則在線粒體中通過谷l#酸脫氫酶（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＤＨ邋）逡逑的作用形成ａ－酮戊二酸（ａ－Ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ邋ａｃｉｄ

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋ＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ．邋Ｕｎｄｅｒ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，邋ＫＥＡＰ１邋ｂｉｎｄｓ邋ｔｏ邋ａｎｄ邋ｄｅｇｒａｄｅｓ逡逑ＮＲＦ２邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｈｅ邋ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ邋ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｐａｔｈｗａｙ．邋Ｈｏｗｅｖｅｒ，邋ｕｎｄｅｒ邋ｓｔｒｅｓｓｅｄ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，邋ＮＲＦ２邋ｃａｎ逡逑ｂｅ邋ｒｅｌｅａｓｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｔｈｅ邋ｎｕｃｌｅｕｓ，邋ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ邋ｏｆ邋ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄｓ，邋ａｎｄ邋ｇｌｕｃｏｓｅ．逡逑Ｉ邋ＬａＣｔａｔｅ邋］邐｜逡逑Ｎｏｒｍａｌ邋ｃｅｌｌｓ邐邐邋Ｔｕｍｏｒ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ｗａｒｂｕｒｇ邋ｅｆｆｅｃｔ邋｜逡逑一、—一一一逡逑＾邐＿一ｅ邋叫 ｍｉｎｅ邐Ｌ、＿逡逑１邋＇逡逑圖２．正常及腫v:細(xì)胞對(duì)葡萄糖及谷氨酰胺的代謝差異。相對(duì)于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞利用更多的逡逑葡萄精及谷氬酰胺，尤其是谷氛酰胺的利用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。腫癯細(xì)胞中ＧＬＳ的活性更高，逡逑生成的谷氛酸（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)為腫癯細(xì)胞提供能量，也可以生成ＧＳＨ調(diào)控逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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2 李立明,饒克勤,孔靈芝,姚崇華,向紅丁,翟鳳英,馬冠生,楊曉光,中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查技術(shù)執(zhí)行組;中國居民2002年?duì)I養(yǎng)與健康狀況調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;2005年07期

本文編號(hào)：2610989