【摘要】：癌癥是嚴重威脅人類健康的重大疾病。最新統(tǒng)計結果表明,截至2014年我國癌癥發(fā)病率已接近0.2%,即每年每十萬人中有200個新發(fā)癌癥病例,且死亡率亦高達0.1%,即每年每十萬人中有100人死于癌癥。大約90%的癌癥相關死亡可以歸因于腫瘤轉移,轉移灶對病人生命健康的威脅遠大于原發(fā)性腫瘤。腫瘤轉移過程是多步驟復雜的級聯(lián)反應,最初腫瘤細胞脫離原發(fā)灶遷移侵襲至周圍組織器官,進而進入血管或者淋巴管中,借助于循環(huán)系統(tǒng)到達遠端組織器官,在適宜條件下,循環(huán)腫瘤細胞滲出血管或淋巴管并在新的環(huán)境中增殖形成轉移灶。人們對于腫瘤轉移研究工作已經進行幾十年,但目前仍有眾多機制尚未明了。Specificity Protein 1(Sp1)是最早發(fā)現(xiàn)的轉錄因子之一,廣泛參與調控細胞增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程,并且其異常表達與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關。Sp1通過調控多種原癌基因以及抑癌基因的轉錄活性而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展以及轉移過程,如TP53、p21等都是Sp1靶基因。人類基因組中有超過12 000個Sp1結合位點,目前人們對于其轉錄調控的靶基因研究多集中于蛋白編碼基因,而人類基因組中97%以上序列都為非編碼基因,因此我們推測Sp1可能通過調控非編碼基因影響癌癥發(fā)展進程。Micro RNA是一類種間保守的小分子非編碼RNA,長度只有19~22 nt,通過自身種子序列與靶基因m RNA以堿基互補配對方式結合,從而導致m RNA降解或抑制其翻譯。近些年來人們發(fā)現(xiàn)micro RNA參與各種生理活動的調控,并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉移過程密切相關。本研究首先利用蛋白酶體抑制劑處理細胞后,發(fā)現(xiàn)SP1表達水平降低,同時一系列mi RNA表達水平發(fā)生了變化,其中mi R-3178變化最為明顯。在肺癌、前列腺癌、乳腺癌細胞系中SP1表達水平與mi R-3178負相關,過表達外源SP1導致mi R-3178表達水平降低。通過生物信息學方法預測,發(fā)現(xiàn)mi R-3178啟動子區(qū)域包含三個潛在的Sp1結合位點,分別位于轉錄起始位點上游-799至-788bp、-97至-88 bp、-82至-73 bp處。通過熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)以及染色質免疫共沉淀(Ch IP)實驗,證明Sp1通過結合至mi R-3178啟動子上游-82至-73bp處結合位點抑制其轉錄活性。利用在線數(shù)據(jù)庫Oncomine與GEO,分析比較臨床腫瘤患者組織中SP1表達水平,發(fā)現(xiàn)其在轉移灶中表達水平顯著增高。對比不同轉移能力腫瘤細胞系發(fā)現(xiàn)高轉移細胞中mi R-3178表達水平明顯低于相應低轉移細胞系。利用劃痕實驗以及Transwell小室實驗檢測細胞遷移侵襲,發(fā)現(xiàn)mi R-3178在體外顯著抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲能力。利用裸鼠轉移模型以及活體成像系統(tǒng)觀察到前列腺癌細胞在肺臟、肝臟以及淋巴結中可形成明顯的轉移灶。通過HE染色,并利用標記腫瘤細胞的紅色熒光蛋白指示定位,同時結合DAPI染色方法證實這些遠端組織中轉移灶的存在;而mi R-3178過表達則明顯抑制轉移灶形成,故體內實驗進一步證實mi R-3178對腫瘤轉移的抑制作用。TRIO and F-actin binding protein(TRIOBP)通過促進偽足的形成而影響胰腺癌的侵襲與浸潤。TRIOBP蛋白有三種異構體,分別為TRIOBP-5/4/1,在本研究所使用的細胞系中TRIOBP-1是主要表達形式,TRIOBP-5表達水平較低,而TRIOBP-4不表達。利用在線生物信息學軟件預測,在TRIOBP m RNA 3'UTR區(qū)域存在mi R-3178種子序列的互補序列。通過雙熒光素酶報告基因分析證實mi R-3178能夠結合至TRIOBP的3'UTR區(qū)域并抑制熒光素酶活性。高轉移細胞系其TRIOBP表達水平明顯高于相應的低轉移細胞系,利用mi R-3178類似物或抑制劑改變細胞內mi R-3178水平后,TRIOBP的m RNA以及蛋白水平也相應下調或上調。另外,TRIOBP-1能夠回復mi R-3178對于腫瘤轉移能力的抑制作用,表明mi R-3178通過靶向TRIOBP抑制腫瘤轉移。最后對TRIOBP啟動子區(qū)域進行轉錄因子預測,并通過Ch IP實驗證明該啟動子區(qū)域不含Sp1結合位點,Sp1不會通過結合TRIOBP啟動子區(qū)域調控其轉錄活性。綜上所述,本研究揭示了Sp1-mi R-3178-TRIOBP通路對于腫瘤轉移的調控。通過體內外實驗證實mi R-3178通過靶向TRIOBP影響腫瘤細胞的遷移與侵襲能力,進而影響癌癥的轉移進程。而mi R-3178啟動子區(qū)域存在Sp1結合位點,后者抑制mi R-3178的轉錄活性。鑒于Sp1在轉移能力較強的腫瘤組織中普遍高表達,本研究提示利用mi R-3178降低Sp1高表達癌細胞轉移能力的潛在應用。
【圖文】：

哈爾濱工業(yè)大學理學博士學位論文面?zhèn)巫阈纬梢约凹毎\動等生理過程，另外在腫瘤細胞滲出血管淋巴管也與細胞骨架重構以及侵襲性偽足形成相關，因此 TRIOBP 通過調控細以及偽足形成影響腫瘤轉移多個不同環(huán)節(jié)。綜和上述報道以及本課題初結果，，Sp1-miR-3178-TRIOBP 通路中三個節(jié)點在腫瘤轉移過程中起到控作用。鑒于 Sp1 異常表達在多種腫瘤中普遍存在，該通路對于臨床中瘤轉移具有較大的潛在應用價值。20040

第 1 章 緒 論MMP-9 等[4, 5]，已經被報道在各種腫瘤細胞中表達明顯升高。在入侵血管或者淋巴管后，腫瘤細胞即可借助于循環(huán)系統(tǒng)到達遠端的組織器官，進而滲出血管淋巴管（Extravasation）。腫瘤細胞滲出血管的過程需借助一系列細胞因子的幫助。有報道表明，腫瘤細胞能夠分泌一系列分子，如 Angptl4、COX-2、MMP-1等，導致轉移灶部位器官毛細血管通透性增加，以利于自身通過[6, 7]。到達遠端組織器官后，腫瘤細胞需要適應新的環(huán)境并繼續(xù)擴增形成轉移灶。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R73-37

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本文編號：2610180