【摘要】：癌癥是嚴重威脅人類健康的重大疾病。最新統(tǒng)計結(jié)果表明,截至2014年我國癌癥發(fā)病率已接近0.2%,即每年每十萬人中有200個新發(fā)癌癥病例,且死亡率亦高達0.1%,即每年每十萬人中有100人死于癌癥。大約90%的癌癥相關(guān)死亡可以歸因于腫瘤轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移灶對病人生命健康的威脅遠大于原發(fā)性腫瘤。腫瘤轉(zhuǎn)移過程是多步驟復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng),最初腫瘤細胞脫離原發(fā)灶遷移侵襲至周圍組織器官,進而進入血管或者淋巴管中,借助于循環(huán)系統(tǒng)到達遠端組織器官,在適宜條件下,循環(huán)腫瘤細胞滲出血管或淋巴管并在新的環(huán)境中增殖形成轉(zhuǎn)移灶。人們對于腫瘤轉(zhuǎn)移研究工作已經(jīng)進行幾十年,但目前仍有眾多機制尚未明了。Specificity Protein 1(Sp1)是最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子之一,廣泛參與調(diào)控細胞增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程,并且其異常表達與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Sp1通過調(diào)控多種原癌基因以及抑癌基因的轉(zhuǎn)錄活性而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程,如TP53、p21等都是Sp1靶基因。人類基因組中有超過12 000個Sp1結(jié)合位點,目前人們對于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因研究多集中于蛋白編碼基因,而人類基因組中97%以上序列都為非編碼基因,因此我們推測Sp1可能通過調(diào)控非編碼基因影響癌癥發(fā)展進程。Micro RNA是一類種間保守的小分子非編碼RNA,長度只有19~22 nt,通過自身種子序列與靶基因m RNA以堿基互補配對方式結(jié)合,從而導(dǎo)致m RNA降解或抑制其翻譯。近些年來人們發(fā)現(xiàn)micro RNA參與各種生理活動的調(diào)控,并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。本研究首先利用蛋白酶體抑制劑處理細胞后,發(fā)現(xiàn)SP1表達水平降低,同時一系列mi RNA表達水平發(fā)生了變化,其中mi R-3178變化最為明顯。在肺癌、前列腺癌、乳腺癌細胞系中SP1表達水平與mi R-3178負相關(guān),過表達外源SP1導(dǎo)致mi R-3178表達水平降低。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測,發(fā)現(xiàn)mi R-3178啟動子區(qū)域包含三個潛在的Sp1結(jié)合位點,分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-799至-788bp、-97至-88 bp、-82至-73 bp處。通過熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)以及染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)實驗,證明Sp1通過結(jié)合至mi R-3178啟動子上游-82至-73bp處結(jié)合位點抑制其轉(zhuǎn)錄活性。利用在線數(shù)據(jù)庫Oncomine與GEO,分析比較臨床腫瘤患者組織中SP1表達水平,發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)移灶中表達水平顯著增高。對比不同轉(zhuǎn)移能力腫瘤細胞系發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移細胞中mi R-3178表達水平明顯低于相應(yīng)低轉(zhuǎn)移細胞系。利用劃痕實驗以及Transwell小室實驗檢測細胞遷移侵襲,發(fā)現(xiàn)mi R-3178在體外顯著抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲能力。利用裸鼠轉(zhuǎn)移模型以及活體成像系統(tǒng)觀察到前列腺癌細胞在肺臟、肝臟以及淋巴結(jié)中可形成明顯的轉(zhuǎn)移灶。通過HE染色,并利用標記腫瘤細胞的紅色熒光蛋白指示定位,同時結(jié)合DAPI染色方法證實這些遠端組織中轉(zhuǎn)移灶的存在;而mi R-3178過表達則明顯抑制轉(zhuǎn)移灶形成,故體內(nèi)實驗進一步證實mi R-3178對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。TRIO and F-actin binding protein(TRIOBP)通過促進偽足的形成而影響胰腺癌的侵襲與浸潤。TRIOBP蛋白有三種異構(gòu)體,分別為TRIOBP-5/4/1,在本研究所使用的細胞系中TRIOBP-1是主要表達形式,TRIOBP-5表達水平較低,而TRIOBP-4不表達。利用在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測,在TRIOBP m RNA 3'UTR區(qū)域存在mi R-3178種子序列的互補序列。通過雙熒光素酶報告基因分析證實mi R-3178能夠結(jié)合至TRIOBP的3'UTR區(qū)域并抑制熒光素酶活性。高轉(zhuǎn)移細胞系其TRIOBP表達水平明顯高于相應(yīng)的低轉(zhuǎn)移細胞系,利用mi R-3178類似物或抑制劑改變細胞內(nèi)mi R-3178水平后,TRIOBP的m RNA以及蛋白水平也相應(yīng)下調(diào)或上調(diào)。另外,TRIOBP-1能夠回復(fù)mi R-3178對于腫瘤轉(zhuǎn)移能力的抑制作用,表明mi R-3178通過靶向TRIOBP抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。最后對TRIOBP啟動子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測,并通過Ch IP實驗證明該啟動子區(qū)域不含Sp1結(jié)合位點,Sp1不會通過結(jié)合TRIOBP啟動子區(qū)域調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。綜上所述,本研究揭示了Sp1-mi R-3178-TRIOBP通路對于腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控。通過體內(nèi)外實驗證實mi R-3178通過靶向TRIOBP影響腫瘤細胞的遷移與侵襲能力,進而影響癌癥的轉(zhuǎn)移進程。而mi R-3178啟動子區(qū)域存在Sp1結(jié)合位點,后者抑制mi R-3178的轉(zhuǎn)錄活性。鑒于Sp1在轉(zhuǎn)移能力較強的腫瘤組織中普遍高表達,本研究提示利用mi R-3178降低Sp1高表達癌細胞轉(zhuǎn)移能力的潛在應(yīng)用。
【圖文】：

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位論文面?zhèn)巫阈纬梢约凹毎\動等生理過程，另外在腫瘤細胞滲出血管淋巴管也與細胞骨架重構(gòu)以及侵襲性偽足形成相關(guān)，因此 TRIOBP 通過調(diào)控細以及偽足形成影響腫瘤轉(zhuǎn)移多個不同環(huán)節(jié)。綜和上述報道以及本課題初結(jié)果，，Sp1-miR-3178-TRIOBP 通路中三個節(jié)點在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到控作用。鑒于 Sp1 異常表達在多種腫瘤中普遍存在，該通路對于臨床中瘤轉(zhuǎn)移具有較大的潛在應(yīng)用價值。20040

第 1 章 緒 論MMP-9 等[4, 5]，已經(jīng)被報道在各種腫瘤細胞中表達明顯升高。在入侵血管或者淋巴管后，腫瘤細胞即可借助于循環(huán)系統(tǒng)到達遠端的組織器官，進而滲出血管淋巴管（Extravasation）。腫瘤細胞滲出血管的過程需借助一系列細胞因子的幫助。有報道表明，腫瘤細胞能夠分泌一系列分子，如 Angptl4、COX-2、MMP-1等，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移灶部位器官毛細血管通透性增加，以利于自身通過[6, 7]。到達遠端組織器官后，腫瘤細胞需要適應(yīng)新的環(huán)境并繼續(xù)擴增形成轉(zhuǎn)移灶。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R73-37

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本文編號：2610180