【摘要】：研究背景和目的:當(dāng)前臨床上應(yīng)用于抗腫瘤的栓塞劑存在適應(yīng)癥狹窄、載藥量小、成本高、介入途徑困難等問題,我們計劃設(shè)計一種新的多肽,即利用某一單克隆抗體的藥物靶向性,加載促凝因子,有針對性性地、高效地誘發(fā)腫瘤血管血栓形成�；谶@一研究思路,我們成功構(gòu)建了融合蛋白tTF-EG3287的重組基因,EG3287是由外顯子7和8編碼的雙環(huán)多肽,tTF是截短組織因子,具有激活外源性凝血反應(yīng);融合蛋白tTF-EG3287發(fā)揮抗腫瘤作用必須首先由載體分子EG3287準確定位到腫瘤血管內(nèi)皮細胞,效應(yīng)分子tTF誘發(fā)腫瘤血管血栓形成,導(dǎo)致腫瘤細胞缺血壞死,從而達到治療目的。實驗方法:重組質(zhì)粒tTF-EG3287的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化等步驟已在前期實驗基礎(chǔ)上完成。LB平板挑選高表達菌株后,過夜培養(yǎng),然后以1∶100比例擴大培養(yǎng),生長至對數(shù)期添加誘導(dǎo)劑IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)6-8h;統(tǒng)一收菌,由12%SDS-PAGE凝膠電泳及考馬斯亮藍染色對不同的蛋白表達量進行驗證及比較;不斷優(yōu)化IPTG的誘導(dǎo)濃度及時間。超聲破菌后,包涵體復(fù)合物經(jīng)多次洗滌、離心再反復(fù)攪拌溶解后過鎳柱純化。蛋白復(fù)性在含梯度尿素的PBS系統(tǒng)中透析完成。免疫熒光共聚焦法和血栓彈力圖檢測法檢測蛋白活性。構(gòu)建結(jié)直腸癌移植瘤模型后,隨機分組,每組5只,分別為Saline組(PBS),tTF-EG3287治療組和tTF治療組,蛋白經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈注射間斷給藥,每次給藥前測瘤體積。Cy5.5標記融合蛋白tTF-EG3287和tTF,經(jīng)尾靜脈注入荷瘤裸鼠體內(nèi)后,活體成像觀察藥物的生物學(xué)分布,24h后處死裸鼠,解剖分離瘤體和各組織器官,繼續(xù)成像;病理切片HE染色,評價藥物的靶向栓塞作用。實驗結(jié)果:本實驗純化濃縮得到的融合蛋白tTF-EG3287濃度達2.1mg/mL,純度85%,體外促凝活性及細胞靶向結(jié)合作用明顯;在結(jié)腸癌荷瘤裸鼠實驗中,連續(xù)治療27d后,tTF-EG3287與tTF治療組裸鼠移植瘤平均體積均小于Saline對照組,與對照組相比,tTF治療組差異無顯著差異,而tTF-EG3287治療組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=5,P0.01),tTF-EG3287的荷瘤裸鼠TGI(抑瘤率)為79.2%(n=5,P0.01),tTF的TGI為48.5%(n=5,P0.05);活體成像實驗中,tTF-EG3287能在荷瘤裸鼠體內(nèi)靶向富集于腫瘤組織,在除肺外的其他正常組織器官富集很少,而tTF無特定靶向性;24h后器官成像顯示tTF-EG3287能穩(wěn)定、持久地靶向富集于腫瘤組織,而tTF在各臟器及腫瘤內(nèi)幾乎無富集;病理切片HE染色顯示tTF-EG3287治療組腫瘤血管內(nèi)有混合血栓形成,而tTF治療組的各器官未見明顯缺血壞死灶,表現(xiàn)基本正常。結(jié)論:本實驗優(yōu)化了包涵體目的蛋白的純化及活性鑒定等步驟;融合蛋白tTFEG3287生物學(xué)作用穩(wěn)定,在結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤體內(nèi),能準確分布于癌組織,靶向栓塞腫瘤血管,抑制腫瘤細胞的生長。
【圖文】：

圖 1-1 tTF-EG3287 高效表達菌株的篩選Screening of bacteria colonies with highly expression yields of tTF:Marker;2:Induced without IPTG;3-12:Induced by 0.5mmol/L IPT 1-1 所示，，2-12 號管在約 35.0 KDa 處不同程度地表達 tTF-EG 的陰性對照和 3-12 管相同濃度 IPTG 誘導(dǎo)表達的目的蛋白誘異，但仍有少量表達，這可能與 IPTG 的作用濃度和時間有關(guān)優(yōu)表達菌株，用細菌凍存液-20 ℃留種保存。 IPTG 誘導(dǎo)濃度

圖 1-1 tTF-EG3287 高效表達菌株的篩選 Screening of bacteria colonies with highly expression yields of tTF1:Marker;2:Induced without IPTG;3-12:Induced by 0.5mmol/L IPTG 1-1 所示，2-12 號管在約 35.0 KDa 處不同程度地表達 tTF-ETG 的陰性對照和 3-12 管相同濃度 IPTG 誘導(dǎo)表達的目的蛋白誘異，但仍有少量表達，這可能與 IPTG 的作用濃度和時間有關(guān)優(yōu)表達菌株，用細菌凍存液-20 ℃留種保存。 IPTG 誘導(dǎo)濃度
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳斌;陳余清;蔡映云;;抗血管生成治療腫瘤研究的進展[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);2006年07期

2 顧晉 ,邢加迪;結(jié)腸癌治療指南[J];中華胃腸外科雜志;2005年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 關(guān)明;組織因子在膠質(zhì)瘤中的表達及其促血管生成作用的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 何杰;靶向Neuropilin-1的融合蛋白tTF-EG3287選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞[D];廈門大學(xué);2009年

本文編號：2605223