發(fā)布時間：2020-03-28 20:20

【摘要】：目的:結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,它的發(fā)病率和死亡率在男性和女性患者中均位列第三位。盡管隨著手術技術的提高和放化療方案的完善,結直腸癌患者的預后得到了較大改善,但仍有近50%的患者出現局部復發(fā)和遠位轉移。因此,找到一種敏感的分子標志物來預測結直腸癌患者的預后是當今的研究熱點。Zeste基因增強子同源物2(Enhancer of zeste homologue 2,EZH2)是多梳蛋白家族(PcG)中的一員,通過組蛋白甲基轉移酶中高度保守的SET區(qū)域可催化組蛋白H3第27位(H3K27m3)賴氨酸進行甲基化修飾,從而抑制多種抑癌基因的表達,發(fā)揮其調控作用。本研究擬采用免疫組化方法檢測EZH2和H3K27m3在55例結直腸癌組織及其配對的正常組織中的表達情況,并結合結直腸癌的臨床病理特征分析EZH2和H3K27m3在結直腸癌中的表達模式及兩者的表達相關性,并分析EZH2和H3K27m3對結直腸癌患者預后的預測作用。隨后,通過體外構建敲低EZH2的結腸癌細胞株進一步驗證EZH2對結腸癌細胞侵襲能力的調控作用。方法:1.收集2012年1月至2012年12月滄州市中心醫(yī)院腫瘤外科收治的55例結直腸癌患者的成對癌及癌旁組織。利用免疫組化方法檢測EZH2及H3K27m3蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達情況,比較兩者在癌組織及癌旁組織的表達水平,并測定二者表達的相關性。2.收集55例患者的臨床病理信息,結合EZH2及H3K27m3在癌組織中的表達情況分析兩者表達模式與結直腸癌臨床病理特點的關系。3.結合EZH2、H3K27m3在癌組織中的表達情況及結直腸癌患者的隨訪結果,分析兩者與患者總生存率及無病生存期的關系及對預后的預測作用。4.應用實時定量熒光PCR及Western Blot方法檢測RKO、HCT-116、LoVo及DLD-1四種結腸癌細胞系中EZH2的表達情況,并選擇表達較高的細胞系轉染siRNA構建敲低EZH2表達的細胞系,并應用實時熒光PCR及Western Blot方法驗證敲低效果。5.應用對照組細胞系及敲低EZH2的結腸癌細胞系進行Transwell細胞侵襲實驗,探索EZH2對結腸癌細胞侵襲能力的調控作用。6.所得數據應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理。免疫組化結果采用卡方檢驗及Spearman相關性檢驗進行分析;Kaplan-Meier法用于繪制患者的生存曲線,單因素及多因素生存分析應用COX回歸模型進行。所有數據用mean±SD表示,兩獨立樣本的比較應用成組t檢驗來進行分析,多組間均數比較應用單因素方差來進行分析,多樣本均數間多重比較應用Tukey檢驗。每組實驗至少獨立重復3次,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義,置信區(qū)間在95%置信水平表示。結果:1.在本研究中的55例結直腸癌標本中,EZH2的高表達率為58.2%,H3K27me3的高表達率為45.5%。配對正常組織中,EZH2的高表達率僅為14.5%,H3K27me3的高表達率僅為18.2%。將EZH2和H3K27me3的IRS評分做統(tǒng)計學分析發(fā)現,兩者在癌組織與配對正常組織表達水平有顯著統(tǒng)計學差異(P0.001)(圖1)。2.EZH2和H3K27me3蛋白的表達水平呈現明顯的正相關(r~2=0.2396,P=0.0001)。3.利用χ~2檢驗分析EZH2和H3K27me3與臨床病理特征之間的關系發(fā)現EZH2和H3K27me3的高表達與更多的淋巴結轉移(EZH2,P=0.008;H3K27me3,P=0.021)以及遠處轉移(EZH2,P=0.003;H3K27me3,P=0.002)顯著相關;并且,EZH2的高表達患者更容易發(fā)生脈管侵犯(P=0.009)。4.單因素預后分析顯示EZH2和H3K27me3高表達預示著更短的OS EZH2:HR 4.56,95%CI 1.31-15.78,P=0.008,H3K27me3:HR 3.86,95%CI1.46-10.19,P=0.003)和DFS(EZH2:3.89,95%CI 1.24-12.17,P=0.019;H3K27me3:2.85,HR 95%CI 1.69-6.98,P=0.011)。5.進一步多因素分析發(fā)現,經過臨床病理因素矯正后,H3K27me3和EZH2并不是OS(EZH2:HR 1.77,95%CI 0.48-6.40,P=0.384;H3K27me3:HR 95%CI 2.04 0.44-9.51,P=0.361)和DFS(EZH2:HR 1.03,95%CI0.34-3.12,P=0.947;H3K27me3:HR 3.19,95%CI 0.79-12.76,P=0.101)的獨立預后因素;而TNM臨床分期是唯一的獨立預后因子(OS:P=0.024,DFS:P=0.012)。6.qPCR及Western blot法測定RKO、HCT-116、LoVo、DLD-1四種結腸癌細胞中EZH2 mRNA及EZH2蛋白相對表達量,EZH2在RKO及LoVo細胞中表達最高,結果具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.通過轉染siRNA成功建立敲低EZH2的RKO及LoVo細胞模型,qPCR及Western blot法驗證敲低效果,EZH2在RKO-si EZH2-1、RKO-siEZH2-2及LoVo-siEZH2-1、LoVo-siEZH2-2細胞株中相較于在RKO-scramble及LoVo-scramble細胞株中表達明顯降低,結果具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。8.應用Transwell實驗檢測體外EZH2下調后對RKO與LoVo細胞侵襲能力的影響,結果顯示,與RKO-scramble及LoVo-scramble細胞相比,RKO-siEZH2及LoVo-siEZH2的侵襲能力顯著降低,統(tǒng)計學分析顯示有顯著性差異(P0.001)。結論:1.EZH2及H3K27me3在結直腸癌組織中的表達較其配對正常組織中升高,且EZH2及H3K27me3的在癌組織中的表達成正相關。2.在結直腸癌組織中,EZH2及H3K27me3在病理學分期較晚、發(fā)生淋巴結轉移及遠位轉移的患者中表達較高,EZH2在具有脈管瘤栓患者中表達也較高。3.EZH2和H3K27me3在結直腸癌組織中高表達預測患者的OS及DFS均較短,有較差預后,但不是獨立的預后預測因子。4.成功構建瞬時敲低EZH2的RKO-siEZH2及Lo Vo-siEZH2細胞株,RKO-siEZH2及LoVo-siEZH2細胞株侵襲能力減弱。
【圖文】：

17圖 1 EZH2 和 H3K27me3 在結直腸癌組織及配對正常組織中的表達Fig.1 Expresion of EZH2 and H3K27me3 in colorectal cancer and itpaired mormal tissues. (A, B, E) EZH2 and (C, D, F) H3K27me3 wermainly nuclear positive and were highly expressed in cancer tissues bulow expressed in normal tissues (200×). Expression level between canceand normal tissures was significantly different (P<0.001)

18圖 2 EZH2 和 H3K27me3 表達水平的相關性Fig.2 Correlation between expression of EZH2 and H3K27me3. In thesame case, high expresion of (A) EZH2 always accompanied with highexpression of (B) H3K27me3, The lower expresion level of (C) EZH2, thelower (D) H3K27me3（200×）. (E) The expression levels of EZH2 andH3K27me3 showed a significant positive correlation.
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.35

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本文編號：2604868