【摘要】：背景:肺癌是世界范圍內(nèi)致死率首位的癌癥,而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌總數(shù)的80-85%,其有效治療對(duì)提升人類健康水平意義重大。傳統(tǒng)的手術(shù)治療和放化療則由于適應(yīng)性、耐藥和毒副作用在治療中捉襟見(jiàn)肘。近年來(lái),基于驅(qū)動(dòng)基因的靶向治療在NSCLC中大放異彩,然而耐藥和不敏感問(wèn)題依然存在,因此NSCLC的惡性機(jī)制需要繼續(xù)深入研究。蛋白的乙酰化和去乙�；揎椩谏顒�(dòng)中廣泛存在且作用關(guān)鍵。NAD依賴的去乙�；赋聊畔⒄{(diào)節(jié)因子3(NAD-dependent deacetylase sirtuin-3,SIRT3)是機(jī)體內(nèi)重要的去乙酰化酶,通過(guò)去乙�；饔谜{(diào)控重要蛋白的功能,廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞生命進(jìn)程,影響多種疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸。由于NSCLC的遺傳異質(zhì)性以及SIRT3底物廣泛性等復(fù)雜影響因素,SIRT3在NSCLC中的作用存在爭(zhēng)議,相應(yīng)的分子機(jī)制有待闡明。因此,探索SIRT3對(duì)NSCLC的作用及相應(yīng)分子機(jī)制將對(duì)理解NSCLC的惡性進(jìn)展規(guī)律乃至治療提供新的理論依據(jù)。目的:探索SIRT3對(duì)NSCLC惡性進(jìn)展的作用以及相應(yīng)分子機(jī)制。方法:(1)收集70對(duì)NSCLC腫瘤組織及相應(yīng)正常組織標(biāo)本和臨床信息。采用免疫組化、蛋白印跡及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)探索SIRT3在NSCLC臨床組織和正常組織中mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的差異;(2)采用免疫組化定量統(tǒng)計(jì)方法分析SIRT3和NSCLC臨床病理特征的關(guān)系以及SIRT3和NSCLC增殖指標(biāo)Ki-67表達(dá)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)活化的關(guān)系;(3)采用RNA干涉技術(shù)和質(zhì)粒過(guò)表達(dá)技術(shù)建立SIRT3低表達(dá)和過(guò)表達(dá)NSCLC細(xì)胞系(H520:SIRT3-;SW900:SIRT3-;H520:SIRT3+),利用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)SIRT3含量對(duì)Akt磷酸化水平的影響,采用激光共聚焦技術(shù)、蛋白免疫共沉淀技術(shù)探索SIRT3和Akt的相互作用關(guān)系;(4)采用免疫組化技術(shù)探索磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、SIRT3、p53在NSCLC組織中的相關(guān)性;采用蛋白印跡技術(shù)探索PTEN和SIRT3在NSCLC細(xì)胞系中蛋白表達(dá)狀況,根據(jù)結(jié)果采用RNA干涉技術(shù)和質(zhì)粒過(guò)表達(dá)技術(shù)建立不同PTEN表達(dá)背景下,SIRT3高低表達(dá)的細(xì)胞模型(H520:PTEN-/SIRT3-、PTEN+/SIRT3-;A549:PTEN-/SIRT3+、PTEN+/SIRT3+);(5)在上述細(xì)胞模型中,采用蛋白印跡技術(shù)和蛋白免疫共沉淀技術(shù)探索不同PTEN表達(dá)背景下,SIRT3對(duì)p53含量的影響,以及借助泛素蛋白酶體途徑相關(guān)抑制劑探索SIRT3對(duì)p53泛素化降解路徑的調(diào)控作用;(6)利用激光共聚焦技術(shù)、蛋白免疫共沉淀技術(shù)探索SIRT3和p53的相互作用關(guān)系,并利用上述細(xì)胞模型,探索PTEN缺失背景下,SIRT3對(duì)p53的去乙酰化修飾作用。結(jié)果:(1)SIRT3在NSCLC臨床組織中較正常組織顯著高表達(dá);(2)SIRT3和病人預(yù)后相關(guān),高表達(dá)SIRT3病人生存期較短;SIRT3表達(dá)和NSCLC的病理分型有關(guān),其中鱗癌表達(dá)較高;SIRT3和其余病理特征無(wú)明顯關(guān)聯(lián);(3)在NSCLC組織中,SIRT3和惡性增殖指標(biāo)Ki-67、p-Akt(磷酸化活化的Akt)呈現(xiàn)正相關(guān);在NSCLC細(xì)胞系中,SIRT3可以與Akt共定位和共沉淀;在NSCLC細(xì)胞系中SIRT3可以促進(jìn)Akt的磷酸化活化;(4)在NSCLC組織中,PTEN呈現(xiàn)低表達(dá),在此背景下,呈現(xiàn)出SIRT3的高表達(dá)和p53的相應(yīng)低表達(dá)。在PTEN缺失的NSCLC細(xì)胞系中,SIRT3可以促進(jìn)泛素蛋白酶體介導(dǎo)的p53降解,而在PTEN存在的情況下,卻失去這種作用;(5)在PTEN缺失的NSCLC細(xì)胞系中,SIRT3可以去乙酰化p53的賴氨酸320/382位點(diǎn),這種翻譯后修飾可能和p53的穩(wěn)定相關(guān)。結(jié)論:(1)SIRT3在NSCLC組織中高表達(dá),且和惡性增殖指標(biāo)Ki-67正相關(guān),同時(shí)SIRT3的高表達(dá)也預(yù)示著相對(duì)較差的預(yù)后,這些線索提示SIRT3可能在NSCLC扮演著癌基因的作用;SIRT3的表達(dá)量與NSCLC的病理分型相關(guān),但是NSCLC分期分化等惡性程度特征沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián),這可能歸因于腫瘤的異質(zhì)性和個(gè)體遺傳背景的差異性以及SIRT3作用底物的廣泛性。這些均提示SIRT3在NSCLC中的機(jī)制復(fù)雜多樣;(2)p-Akt是促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的中心樞紐,Akt的去乙酰化可以顯著影響其磷酸化活化,而SIRT3是細(xì)胞內(nèi)重要的去乙�；�,這些線索提示SIRT3可能通過(guò)去乙酰化修飾促進(jìn)Akt的磷酸化活化,進(jìn)而促進(jìn)NSCLC的惡性進(jìn)程。本課題發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中SIRT3和p-Akt正相關(guān),同時(shí)在NSCLC細(xì)胞系中,SIRT3能夠促進(jìn)Akt的磷酸化活化;并且SIRT3可以和Akt發(fā)生共沉淀和共定位,這些結(jié)果部分作證了SIRT3通過(guò)調(diào)節(jié)Akt影響NSCLC的科學(xué)假說(shuō);(3)p53的去乙酰化修飾抑制了其抑癌功能,而PTEN的去乙�；揎梽t促進(jìn)其腫瘤抑制功能,這些提示在不同遺傳背景的腫瘤中,去乙酰化修飾會(huì)發(fā)揮不同的作用。本課題中,在NSCLC組織中,PTEN呈現(xiàn)低表達(dá),而SIRT3高表達(dá),同時(shí)p53低表達(dá),這提示在特定PTEN缺失背景下的NSCLC中,SIRT3可能通過(guò)抑制p53含量來(lái)發(fā)揮自身的癌基因作用;同時(shí),我們?cè)贜SCLC模型中進(jìn)一步揭示了在PTEN缺失的背景下,SIRT3可以促進(jìn)泛素蛋白酶體介導(dǎo)的p53的降解;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SIRT3可以去乙酰化p53的賴氨酸320/382位點(diǎn),而相應(yīng)位點(diǎn)的去乙�；揎梽t抑制了p53功能。因此這些結(jié)果提示了SIRT3在PTEN缺失背景下,通過(guò)對(duì)p53的調(diào)節(jié)影響NSCLC的惡性進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2604262