【摘要】：研究背景:乳腺癌(Breast Cancer)目前已經(jīng)成為女性癌癥發(fā)病率的第一名。Cancer Statistics報道2016年美國新增乳腺癌患者1685,210例,死亡595,690例,總死亡率僅僅低于肺癌,位居第二位[1]。Cancer Statistics in China數(shù)據(jù)顯示在我國乳腺癌的發(fā)病率逐年增加,在城市地區(qū)已經(jīng)位列女性癌癥死亡率的首位。雖然隨著醫(yī)療水平的提高,乳腺癌的手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、化學治療等治療手段的長足進步,死亡率有所下降,但是對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌仍沒有行之有效的控制措施,最終導致治療失敗患者死亡[2]。乳腺癌根據(jù)ER(Estrogen receptor),PR(Progesterone receptor)以及HER2(Human epidermal growth factor receptor-2)為劃分標準,主要分為4種類型:HER2過表達型(ER-/PR-/HER2+),luminal A,luminal B,三陰型(TNBC,ER-/PR-/HER2-)[3]。但乳腺癌屬于異質(zhì)性疾病,即使是同一個病理分型的病人之間由于分子水平上存在較大差異,治療靶點也不盡相同[4]。隨著大量的臨床治療數(shù)據(jù)的回饋,學者們越來越發(fā)現(xiàn)靶向治療的重要性。ARPC2(Actin related protein 2/3 complex)是肌動蛋白相關(guān)蛋白復合體(Actinrelated protein,Arp)七個亞基其中之一[5],Arp是一種含量豐富的真核細胞蛋白。主要介導肌動蛋白單體和一些細胞內(nèi)小分子、ATP相互作用多聚化,即肌動蛋白核化(nucleation),從而形成微絲組裝成細胞骨架,維持細胞形態(tài)[6]。參與細胞分裂及細胞運動收縮,使吞噬微粒、病毒以及胞內(nèi)寄生菌等多種胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生位移等多種生理功能[7-8]。ARPC2最先是在棘阿米巴中發(fā)現(xiàn),主要在組織的細胞質(zhì)和細胞膜中表達[9]。參與細胞內(nèi)肌動蛋白聚合的控制,在進化上相對保守,迄今為止僅發(fā)現(xiàn)了兩種可選剪接的變體,在微絲的核化中起關(guān)鍵作用[10-11]。相鄰兩條微絲通過分支處的ARPC2作用以70度角的方式進行連接,引起質(zhì)膜的改變,使細胞運動前行�，F(xiàn)階段對于ARPC2在惡性腫瘤中所發(fā)揮的作用以及其潛在的作用機制的研究仍處于起步階段。有研究發(fā)現(xiàn)ARPC2可以通過細胞內(nèi)牽引力場調(diào)節(jié)細胞體力[12]。ARPC2在胃癌細胞中表達水平升高并且具有促進了胃癌細胞增殖和侵襲力的作用[13],但ARPC2在乳腺癌細胞中的具體生物學作用未見報道。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)展過程中扮演重要的角色,N-cadherin,Vimtin,E-cadherin等標志物的改變提示EMT的發(fā)生。目前,已知多條信號通路參與調(diào)節(jié)EMT程序,如TGF-β,Hedgehog,Wnt以及Notch等,這些信號通路可以和一些轉(zhuǎn)錄因子形成復雜的信號網(wǎng)絡,從而穩(wěn)定和維持細胞的間質(zhì)表型。腫瘤細胞中肌動蛋白可以通過結(jié)構(gòu)變化利用變形場和已和已知基質(zhì)的彈性物質(zhì)引起腫瘤細胞骨架重塑,從而提高細胞內(nèi)牽引力,提升腫瘤細胞遷移和侵襲能力。因此,我們推斷ARPC2蛋白不僅具有調(diào)控乳腺癌細胞骨架重塑、細胞牽引力的作用,而且可能具有調(diào)控乳腺癌細胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移的作用。本課題發(fā)現(xiàn)ARPC2在乳腺癌癌旁正常組織中低表達,乳腺癌組織中高表達,并且和EMT標志蛋白有密切相關(guān)性。我們通過過表達或敲低乳腺癌細胞系A(chǔ)RPC2表達水平,利用細胞功能實驗觀察乳腺癌細胞的生物學功能變化,如增殖、侵襲、凋亡、周期等等,以及EMT各項指標的表達情況。發(fā)現(xiàn)ARPC2能夠誘導乳腺癌細胞增殖獲得間質(zhì)細胞特征,增強細胞的遷移和侵襲能力;利用免疫共沉淀與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(IP-MS)篩選,查詢差異蛋白GO富集分析和KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)ARPC2參與TGF-β/Smad信號通路。為了探討ARPC2及TGF-β/Smad信號通路在乳腺癌EMT過程中的信號轉(zhuǎn)導及相互作用機制,運用Western-blot技術(shù)檢測TGF-β抑制劑(SB43)及TGF-β刺激后細胞EMT各指標的表達情況,發(fā)現(xiàn)ARPC2能夠增強TGF-β信號通路,從而促進EMT的發(fā)生。同時在TGF-β誘導乳腺上皮細胞發(fā)生EMT的過程中,也能夠上調(diào)ARPC2的表達,并且ARPC2的上調(diào)對于TGF-β誘導的EMT是必需的。本研究首次發(fā)現(xiàn)ARPC2能夠促進乳腺癌細胞EMT轉(zhuǎn)化程序?qū)е氯橄侔┣忠u遷移,通過參與乳腺癌細胞中TGF-β/Smad信號通路。這一發(fā)現(xiàn)為ARPC2作為預測乳腺癌預后的標志分子以及其作為乳腺癌靶向治療的目標提供了重要的研究基礎(chǔ)。研究目的:研究乳腺癌細胞株和乳腺癌患者中ARPC2的表達情況,并探討其是否參與TGF-β介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進而影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。研究內(nèi)容:第一部分ARPC2在乳腺癌中的表達水平與作用收集安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院172例乳腺癌根治術(shù)后保存的乳腺癌組織及68例乳腺腺病組織,46例乳腺癌患者術(shù)前和50例正常體檢的女性血清標本。所有納入研究對象的乳腺癌患者術(shù)前均未接受過生物治療、放化療等治療手段,與正常對照組的體檢女性年齡無統(tǒng)計學差異,實驗采用q RT-PCR、免疫印跡和免疫組化方法,檢測血標本中ARPC2的m RNA水平和病理組織標本中ARPC2蛋白表達情況。同時收集整理乳腺癌患者的臨床病理數(shù)據(jù)資料,內(nèi)容包括腫瘤大小、臨床分期、分級、預后以及EMT相關(guān)標志蛋白等,通過統(tǒng)計學相關(guān)性分析,探究ARPC2表達與乳腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性。此外,收集乳腺表皮細胞系:MCF-10A和乳腺癌細胞株MCF7、BT474、T47D、MB-MDA-231,采用免疫印跡以及q RT-PCR的方法檢測ARPC2基因的表達情況,同時分析ARPC2基因在不同乳腺癌細胞系中的差異性表達。通過挖掘公共在線數(shù)據(jù)庫Oncomine microarray database和Bio Portal for Cancer Genomics(http://www.cbioportal.org/)中ARPC2在乳腺癌患者組織樣本中的表達情況,分析ARPC2表達在乳腺癌組及正常對照組的差異,從而明確ARPC2在乳腺癌組織中的表達狀態(tài)及其臨床研究價值。第二部分ARPC2在乳腺癌進展中的作用以及初步機制研究我們前期的研究發(fā)現(xiàn)ARPC2與乳腺癌的預后有密切相關(guān)性,我們推測ARPC2可以作為一個促癌基因在體內(nèi)加速乳腺癌的發(fā)展,為了進一步研究ARPC2對乳腺癌細胞的作用機制,探討其生物學功能。采用si RNA技術(shù)在相對高表達ARPC2基因乳腺癌細胞MDA-MB-231中抑制ARPC2的表達,將過表達ARPC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進相對表達量較少的MCF-7細胞株。采用MTT法檢測細胞株的細胞增殖;流式細胞儀檢測細胞株的細胞周期變化;Annexin V/PI法檢測細胞株的凋亡情況;劃痕實驗、Transwell/Matrigel法觀察細胞株遷移和侵襲的能力;平板克隆形成實驗觀察細胞增殖生長能力。闡述ARPC2表達對乳腺癌細胞增殖以及侵襲能力的影響。體內(nèi)實驗,雌性裸鼠皮下注射過表達ARPC2組和空質(zhì)粒對照組的MCF7細胞,觀察兩組裸鼠移植瘤的生長速度、瘤體重量,肺部轉(zhuǎn)移情況以及免疫組化檢測瘤體Ki67的表達情況。利用免疫共沉淀串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)技術(shù)(IP-MS)篩選ARPC2基因影響乳腺癌細胞的生物學行為的下游通路,通過免疫印跡和蛋白組學等方法驗證用特異性抗體拉低ARPC2后乳腺癌細胞的具體調(diào)控機制,通過查詢差異蛋白GO富集分析和KEGG通路分析,研究ARPC2和乳腺癌細胞EMT轉(zhuǎn)化的相關(guān)性以及可能相關(guān)的下游通路。探討ARPC2如何參與乳腺癌細胞EMT轉(zhuǎn)化過程,以及其對乳腺癌細胞中TGF-β信號通路的調(diào)控作用。從而為ARPC2作為預測乳腺癌預后的標志分子,以及為作為乳腺癌靶向治療的目標提供依據(jù)。研究結(jié)果:第一部分1.在46例乳腺癌患者和相應的50例健康體檢女性血清標本中q RT-PCR檢測結(jié)果顯示:乳腺癌患者血清的ARPC2 m RNA水平相較于正常對照組較高(P0.05);2.免疫組化顯示:ARPC2主要定位于乳腺上皮細胞和癌細胞的細胞質(zhì)或者細胞膜上,172例乳腺癌組織中的ARPC2蛋白陽性細胞比例(48%)高于68例良性乳腺病組織(28%)(P0.05);3.免疫組化ARPC2的陽性表達情況與患者的腫瘤大小,病理學分期,淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),而與其它的其它病理特征如HER2表達量、ER與PR狀態(tài)無關(guān);4.公共在線數(shù)據(jù)庫TCGA顯示,與正常乳腺組織比較,乳腺癌組織ARPC2m RNA表達水平升高(P0.05);5.通過在線數(shù)據(jù)庫Cbioporta生存分析發(fā)現(xiàn)ARPC2與乳腺癌患者的預后具有相關(guān)性;6.逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western Blot結(jié)果顯示:乳腺癌細胞株的ARPC2表達量相較于乳腺正常上皮細胞株MCF10A有所升高(P0.05)。第二部分1.在MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染si RNA和ARPC2-si RNA,在MCF7細胞中轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pc DNA3.1-ARPC2和空質(zhì)粒,相應的ARPC2蛋白水平出現(xiàn)下降或者升高;2.轉(zhuǎn)染ARPC2 si RNA下調(diào)ARPC2后導致細胞增殖、侵襲和遷移能力抑制,促進凋亡;3.注射過表達ARPC2的MCF-7細胞的裸鼠移植瘤生長速度、瘤體大小以及Ki67的表達量顯著高于對照空質(zhì)粒組(P0.05);4.蛋白組學分析顯示:ARPC2的表達與粘附侵襲相關(guān)基因集有高度相關(guān)性;5.過表達ARPC2可以促進EMT的轉(zhuǎn)化,激活TGF-β/Smad信號通路;6.ARPC2可以被TGF-β受體激酶抑制劑SB431542阻斷TGF-β/Smad信號通路逆轉(zhuǎn)對EMT的轉(zhuǎn)化作用。結(jié)論:ARPC2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起促進作用,這一作用可能通過TGF-β/Smad信號通路介導的EMT轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生。
【圖文】：

ARPC2在乳腺癌租和健康對照組外周血中的表達水平

31圖 2.1 免疫組化檢免疫組化 ARPC2 的表達情況:(A)ARPC2 非腫瘤乳腺組織中低表達 (B)ARPC2 非腫瘤乳腺組織中高表達(C)ARPC2 乳腺癌組織低表達 (D)ARPC2 乳腺癌組織高表達
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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本文編號：2601958