發(fā)布時(shí)間：2020-03-11 22:08

【摘要】：肝細(xì)胞肝癌惡性度高,進(jìn)展迅速,預(yù)后差,每年約有60萬新發(fā)病例,為臨床的治療帶來了極大挑戰(zhàn)。近些年來,免疫治療受到較大關(guān)注,其中樹突狀細(xì)胞(DC)介導(dǎo)的免疫治療已在一些腫瘤治療如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、泌尿系腫瘤、腦膠質(zhì)瘤等取得較大進(jìn)展。然而,由于肝臟特殊的免疫生物學(xué)特點(diǎn),肝癌的免疫治療進(jìn)展并不順利。以肝癌細(xì)胞裂解物為抗原,以DCs為瘤苗的免疫治療在肝癌異位小鼠模型的研究取得了較好效果,然而,進(jìn)一步的II期臨床試驗(yàn)在肝細(xì)胞肝癌患者體內(nèi)引起的抗腫瘤免疫應(yīng)答有限。近年來對腫瘤細(xì)胞來源的exosome(TEX)的研究發(fā)現(xiàn),TEX攜帶腫瘤相關(guān)抗原,可作為一些腫瘤免疫治療的天然抗原來源。進(jìn)一步研究顯示,在腎癌和髓性白血病模型上,相較細(xì)胞裂解物,TEX作為抗原,可引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,取得更好的腫瘤抑制效果。然而,在肝癌方面尚缺乏研究。本研究嘗試以肝癌細(xì)胞來源的exosome作為抗原,活化DCs作為瘤苗,通過觀察肝癌小鼠異位及原位模型的腫瘤變化,檢測小鼠系統(tǒng)免疫應(yīng)答及肝癌免疫微環(huán)境來評價(jià)TEX的抗肝癌免疫效果,并進(jìn)一步研究體外對人肝癌細(xì)胞的殺傷作用。通過與肝癌細(xì)胞裂解物的比較,為肝癌免疫治療提供更好抗原選擇,取得更好抑瘤效果。目的:1.評估多種常用的建立肝癌小鼠模型的方法,獲得成瘤效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、均一性好的肝癌小鼠模型,并探索荷瘤小鼠肝癌免疫微環(huán)境的特點(diǎn)。2.探索TEX作為抗原在體外殺傷腫瘤效果。3.探索TEX的體內(nèi)抑瘤效果,肝癌免疫微環(huán)境的變化。4.研究TEX的作用機(jī)制并測試對人肝癌的免疫功能。方法:1.通過尾靜脈注射、脾內(nèi)細(xì)胞注射、肝內(nèi)細(xì)胞注射、肝內(nèi)組織移植等多種方法,建立小鼠肝癌模型,比較不同方法的成瘤時(shí)間、成瘤率,病理特點(diǎn)、轉(zhuǎn)移率等。通過流式和ELISA檢測小鼠外周血免疫細(xì)胞和免疫因子的變化,通過免疫組化染色檢測肝癌內(nèi)部免疫細(xì)胞的浸潤。2.電鏡、nanosight、免疫印跡實(shí)驗(yàn)等多種方法鑒定肝癌細(xì)胞上清中提取的exosome的形態(tài)、大小、純度及特征性蛋白質(zhì)的表達(dá),通過熒光染色研究DC對exosome的攝取,通過流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞表型的變化,應(yīng)用CFSE染色和免疫因子分泌檢測T細(xì)胞的活化,通過乳酸脫氫酶檢測活化的T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。3.測量肝癌異位及原位小鼠模型的腫瘤長徑及短徑,計(jì)算腫瘤體積、記錄各組小鼠生存期,從外周血和腫瘤內(nèi)分離荷瘤小鼠免疫細(xì)胞及血清,通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測荷瘤小鼠外周血免疫活化與抑制性因子的表達(dá),流式分析外周血及肝癌內(nèi)部CD4+及CD8+T細(xì)胞。同時(shí)提取人源肝癌細(xì)胞來源exosome,外周血分離培養(yǎng)人DC及淋巴細(xì)胞,檢測其活化T細(xì)胞能力及對人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。4.通過熒光染色追蹤DC,并通過對免疫缺陷鼠的治療判斷T細(xì)胞在免疫活化中的作用。結(jié)果:1.與肝內(nèi)和脾內(nèi)細(xì)胞接種獲得的多結(jié)節(jié)、分散分布,大小不一的模型相比,肝內(nèi)組織接種建立的肝癌模型單結(jié)節(jié)、均一性好,適于本課題研究。腫瘤內(nèi)可見T淋巴細(xì)胞明顯浸潤,和臨床肝癌患者的情況相近。2.肝癌細(xì)胞來源的exosome表達(dá)AFP、GPC3等腫瘤相關(guān)抗原及腫瘤伴侶蛋白HSP70,且AFP在TEX上富集。TEX作為抗原能被DC攝取,促使DC細(xì)胞成熟,顯著增強(qiáng)其活化T細(xì)胞的能力�；罨腡細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的腫瘤殺傷能力。3.TEX作為抗原能有效抑制腫瘤生長,延長小鼠生存期,改善腫瘤免疫微環(huán)境。TEX在體內(nèi)的免疫活化是T細(xì)胞依賴性的。相對于細(xì)胞裂解物,TEX能引起更強(qiáng)的抗肝癌免疫應(yīng)答。4.TEX能有效殺傷人肝癌細(xì)胞。結(jié)論:1.肝內(nèi)組織接種法建立的原位肝癌模型能反映臨床上肝癌的病理學(xué)和免疫學(xué)特點(diǎn),是一種理想的建立移植型肝癌原位模型的方式。2.TEX是肝癌免疫治療的有效抗原載體,能在體內(nèi)外引起強(qiáng)烈抗腫瘤免疫應(yīng)答,有望成為肝癌免疫治療的重要抗原來源。
【圖文】：

核質(zhì)比增加（圖1 F）。壞死組織中可見大量炎癥細(xì)胞浸潤（圖 1G）。以上說明 Hepa1-6 細(xì)胞在C57BL/6 成瘤率高，腫瘤生長迅速，病理學(xué)特點(diǎn)明顯。肝內(nèi)組織移植一般選擇在皮下瘤瘤徑長至 1cm 左右時(shí)進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，四組長徑至 1cm 所需時(shí)間分別為2.88±0.63 周、2.00±0.71 周、1.75±0.29 周、1.50±0.41 周（表一），可根據(jù)需要選擇細(xì)胞種植數(shù)量，在合適時(shí)機(jī)剝除腫瘤用于原位瘤組織接種。

152：細(xì)胞尾靜脈注射建立原位肝癌模型。A：尾靜脈注射腫瘤分布。從左為肺、心臟、肝和肋骨�？梢钥吹椒紊喜紳M腫瘤結(jié)節(jié)，心臟也被侵犯明顯肉眼可見結(jié)節(jié)，，虛線圈住部分為肋骨腫瘤結(jié)節(jié)。B：尾靜脈注射 染色。從上至下分別為肺、肝和心臟的 HE 染色。右側(cè)圖片為左側(cè)框中放大圖，可見肺和心臟的腫瘤浸潤，肝臟無腫瘤結(jié)節(jié)。圖中標(biāo)尺均為 10
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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5 薩仁高娃;吳巖;肖文華;;exosome與腫瘤免疫治療的研究進(jìn)展[J];感染.炎癥.修復(fù);2008年03期

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8 張堯;張家摸;何百成;羅春麗;吳小候;;腎癌細(xì)胞來源exosome的制備和免疫相關(guān)蛋白組成的初步研究[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

9 元小寧;朱運(yùn)峰;;外泌體(Exosome)及其在腫瘤調(diào)控中的作用[J];中國生物工程雜志;2013年08期

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5 徐保鋒;黃海燕;關(guān)毅;吳宣萱;;膠質(zhì)瘤源性exosome的研究進(jìn)展[A];2011中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

6 Hong-Wei Wang;;Alternative pathways of RNA recruitment in yeast exosome revealed by single particle electron microscopy[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十一次會(huì)員代表大會(huì)暨2014年全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文集——專題報(bào)告一[C];2014年

7 ;Characterations and functions of exosome[A];2012全國臨床微生物與感染免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

8 孫禎;黃赤兵;;各淋巴組織源性exosome的收集方法比較的研究[A];2012中國器官移植大會(huì)論文匯編[C];2012年

9 宋亞軍;黃赤兵;;探討小鼠腸系膜淋巴結(jié)exosome對外周血T細(xì)胞增殖的影響[A];2013中國器官移植大會(huì)論文匯編[C];2013年

10 卜寧;孫秉中;李奇靈;于華;;K562細(xì)胞分泌的exosome電鏡標(biāo)本的制備及觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

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3 副主任醫(yī)師 周德瑞;肝癌病人能生育喂奶嗎[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2007年

4 通訊員 程守勤;五類危險(xiǎn)人群尤需警惕肝癌[N];家庭醫(yī)生報(bào);2009年

5 本報(bào)記者 李娜;肝癌高發(fā)真相探源[N];吉林日報(bào);2013年

6 黃靜　李媛媛;丙肝發(fā)展成肝癌速度或更快[N];人民政協(xié)報(bào);2013年

7 記者 黃才剛;肝癌宜因人施治[N];健康報(bào);2000年

8 鐘肖協(xié);肝癌“偏愛”哪些人[N];陜西日報(bào);2000年

9 黃顯斌邋唐明山;我科學(xué)家在肝癌發(fā)病機(jī)制研究中取得重大進(jìn)展[N];光明日報(bào);2007年

10 福星;肝癌如何早發(fā)現(xiàn)[N];民族醫(yī)藥報(bào);2007年

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5 紀(jì)潤璧;MSC及其exosome在胃炎/癌微環(huán)境中的作用與機(jī)制研究[D];江蘇大學(xué);2015年

6 樓國華;攜帶miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體抗肝癌研究[D];浙江大學(xué);2016年

7 應(yīng)后群;非編碼RNA作為CRC風(fēng)險(xiǎn)評估、療效預(yù)后判斷和臨床診斷標(biāo)志物研究[D];東南大學(xué);2016年

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本文編號：2586370