【摘要】：目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類起源于造血干細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。目前聯(lián)合化療以及化療基礎(chǔ)上的造血干細胞移植是治療AML的主要方法,但存在原發(fā)耐藥、復(fù)發(fā)難治、化療毒副作用大、移植供者局限及GVHD(移植物抗宿主病)等諸多問題,最終導(dǎo)致治療的失敗。為提高治療的效果,減輕傳統(tǒng)化療的毒副作用及交叉耐藥等弊端,新的治療藥物及作用靶點急需被探索。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,依靠其自身RNA為模板,以逆轉(zhuǎn)錄方式延長隨細胞分裂逐漸縮短的端粒,從而導(dǎo)致細胞的永生化及癌變,在急性髓系白血病細胞中高表達,并被證實為腫瘤的特異性標志。研究表明以端粒酶為作用靶點,利用表觀遺傳學(xué)機制,采取改變組蛋白的乙酰化水平等方式,在不改變DNA順序的基礎(chǔ)上影響基因的表達,可達到抑制端粒酶活性,進而產(chǎn)生抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡等抗癌效果。組蛋白去乙�；敢种苿�(histone deacetylases inhibitors,HDACi)西達本胺通過抑制組蛋白去乙酰化酶使細胞蛋白乙�；教岣�,可選擇性的調(diào)控細胞大量基因轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生特異性的腫瘤殺傷效應(yīng)。而三氧化二砷可通過下調(diào)腫瘤細胞端粒酶的活動度、改變細胞周期蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達以及抑制腫瘤內(nèi)血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、調(diào)控凋亡基因等作用,發(fā)揮治療急性髓系白血病的作用。因此,通過改變組蛋白乙�；�,調(diào)控端粒酶的活性,為急性髓系白血病的治療提供了新的思路。西達本胺(Chidamide)是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)全新的組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi),由我國首先自主研發(fā)而成,并被收錄為國家專利,是一種新型的抗腫瘤藥物,目前多以口服制劑作為臨床用藥途徑。該藥目前在多種血液系統(tǒng)腫瘤治療方面已經(jīng)有了應(yīng)用,如皮膚T細胞淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、血管免疫母T細胞淋巴瘤,并在多種惡性腫瘤治療中行臨床試驗治療,具有相對廣泛的抗癌譜系。三氧化二砷(arsenic trioxide,AS2O3)雖為劇毒砒霜的主要成分,但早已成功進入我國傳統(tǒng)中藥的行列,對急性早幼粒細胞白血病(APL)具有明確的治療效果,低劑量三氧化二砷可誘導(dǎo)分化停留于早幼粒細胞階段的白血病細胞,高劑量三氧化二砷可產(chǎn)生細胞毒性,誘導(dǎo)白血病細胞凋亡,已成為臨床治療急性早幼粒細胞白血病的常規(guī)用藥。NCCN的AML診療指南亦明確指出其治療維甲酸耐藥及復(fù)發(fā)難治的急性早幼粒細胞白血病的肯定療效及治療地位。同時,三氧化二砷在多種惡性腫瘤的放化療治療中,可協(xié)同促進其他藥物的藥效,提高放化療的敏感性,在減輕單藥大劑量用藥所致的不良反應(yīng)同時,可增加抗癌效果,在臨床治療中有著舉足輕重的地位。近年來,組蛋白去乙�；敢种苿┳鳛榭鼓[瘤治療的熱點研究對象,不斷被應(yīng)用于臨床及實驗研究。對于應(yīng)用標準化療方案耐藥、不能耐受、難治復(fù)發(fā)型AML患者,尋求一條相對安全有效的治療方案是目前的一個重要課題。因此,本課題應(yīng)用西達本胺、三氧化二砷及兩藥聯(lián)合作用于HL-60細胞(人急性髓系白血病細胞株),觀察西達本胺、三氧化二砷及兩藥聯(lián)合通過作用于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶誘導(dǎo)急性髓系白血病細胞凋亡的時間及量效關(guān)系,及對端粒酶活性影響的作用機制,探討西達本胺、三氧化二砷及兩藥聯(lián)合選擇性誘導(dǎo)急性髓系白血病細胞凋亡的作用機制,為拓寬急性髓系白血病的臨床治療途徑,提高患者總體生存率,提供更多的理論依據(jù)。方法:選取AML細胞株HL-60細胞作為研究對象,并隨機分組:空白對照組,西達本胺單藥組(0.5μmol/L、2μmol/L、4μmol/L),AS2O3單藥組(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L),西達本胺聯(lián)合AS2O3組(0.5μmol/L+1.25μmol/L、4μmol/L+5μmol/L)。評價不同藥物濃度干預(yù)不同時間后對HL-60細胞增殖、凋亡的作用以及對HL-60細胞端粒酶亞單位h TERTm RNA(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶m RNA)及端粒酶h TERT蛋白表達水平的影響,探討兩藥的作用機制。每組實驗均重復(fù)3次。1用CCK8法初篩濃度并檢測不同濃度藥物作用24h、48h、72h對HL-60細胞的增殖抑制率;2用流式細胞術(shù)(FCM)檢測不同濃度藥物作用于HL-60細胞24h、48h、72h后細胞的凋亡率;3用RT-PCR法檢測不同濃度藥物作用HL-60細胞48h后h TERTmRNA的表達水平;4用Western Blot(蛋白印跡)方法檢測不同濃度藥物作用HL-60細胞48h后端粒酶h TERT的蛋白表達水平;5統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果:1西達本胺、AS2O3對HL-60細胞增殖的影響1.1不同濃度西達本胺單藥組和AS2O3單藥組分別對HL-60細胞作用24h、48h、72h,隨著藥物作用濃度遞增,HL-60細胞受到的增殖抑制作用越明顯,增殖抑制率越高;隨著藥物作用時間的遞增,HL-60細胞受到的增殖抑制作用亦越明顯,增殖抑制率亦越高。西達本胺對HL-60細胞增殖抑制率由(16.01±0.34)%增加到(97.09±0.91)%,AS2O3對HL-60細胞增殖抑制率由(13.93±1.03)%增加到(84.40±1.50)%。通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析,對照組、不同處理組相互之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。綜上說明西達本胺單藥、AS2O3單藥均能夠抑制HL-60細胞增殖,并具有劑量-時間依賴性。(Fig.1,Fig.2,Table 1,Table 2)1.2不同濃度的西達本胺、AS2O3行兩藥聯(lián)合對HL-60細胞作用24h、48h、72h,兩藥高濃度聯(lián)合組與兩藥低濃度聯(lián)合組相比,增殖抑制率明顯增高;隨藥物作用時間延長,HL-60細胞增殖抑制率亦逐漸增高,綜合兩種因素,HL-60的增殖抑制率由最低(70.34±1.59)%提高至最高(98.22±0.77)%。且兩藥聯(lián)合組與單藥組相比,聯(lián)合組對HL-60細胞的增殖抑制作用較單藥組明顯增強。通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析,對照組、不同處理組相互之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。說明西達本胺、AS2O3兩藥聯(lián)合可協(xié)同抑制HL-60細胞增殖。(Fig.3,Table 3)2西達本胺、AS2O3對HL-60細胞凋亡的影響2.1不同濃度的西達本胺單藥組、AS2O3單藥組分別對HL-60細胞作用24h、48h、72h,隨著藥物作用濃度遞增,HL-60細胞受到的凋亡作用越顯著,凋亡率越高;隨著藥物作用時間的遞增,HL-60細胞受到的凋亡作用亦越明顯,凋亡率亦越高。西達本胺作用于HL-60細胞,凋亡率由(7.30±0.47)%增加到(25.62±1.53)%,AS2O3作用于HL-60細胞,凋亡率由(12.16±1.08)%增加到(40.97±1.73)%。通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析,對照組、不同處理組相互之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。說明西達本胺單藥、AS2O3單藥均能夠誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡,并具有劑量-時間依賴性。(Fig.4,Table 4,Table 5)2.2不同濃度的西達本胺、AS2O3行兩藥聯(lián)合作用于HL-60細胞24h、48h、72h,兩藥高濃度聯(lián)合組與兩藥低濃度聯(lián)合組相比,凋亡率明顯增高;隨藥物作用時間延長,HL-60凋亡率亦逐漸增高,綜合兩種因素,HL-60的增殖抑制率由最低(19.56±0.77)%提高至最高(78.72±2.47)%。且兩藥聯(lián)合組與單藥組相比,聯(lián)合組對HL-60細胞的促凋亡作用較單藥組明顯增強。通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析,對照組、不同處理組相互之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。說明西達本胺聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞具有協(xié)同促凋亡作用。(Fig.4,Table 6)3西達本胺、AS2O3對HL-60細胞h TERTm RNA表達的影響3.1不同濃度的西達本胺單藥組、AS2O3單藥組作用HL-60細胞48h后,隨著藥物作用濃度遞增,h TERTm RNA的表達水平逐漸下降。西達本胺作用于HL-60細胞,h TERTm RNA的表達量由0.95±0.02減少到0.72±0.05,AS2O3作用于HL-60細胞,h TERTm RNA的表達量由0.91±0.01減少到0.66±0.02。通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析,對照組、不同處理組相互之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。說明西達本胺、AS2O3單藥能夠減少HL-60細胞h TERTm RNA的表達水平,并呈劑量依賴性。(Fig.5,Fig.6,Table 7,Table 8)3.2不同濃度的西達本胺聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用48h后,低濃度兩藥聯(lián)合h TERTm RNA的表達量為0.55±0.02,高濃度兩藥聯(lián)合h TERTm RNA的表達量下降到0.15±0.02,隨著藥物濃度的增加,h TERTm RNA的表達量逐漸下降,各處理組與單藥組及對照組比較,h TERTm RNA的表達量下降明顯,通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析,對照組、不同處理組相互之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。說明西達本胺聯(lián)合AS2O3能夠協(xié)同減少HL-60細胞h TERT m RNA的表達水平。(Fig.5,Fig.6,Table 9)4西達本胺、AS2O3對HL-60細胞h TERT蛋白表達的影響4.1不同濃度的西達本胺單藥組、AS2O3單藥組作用于HL-60細胞48h后,隨著藥物作用濃度遞增,h TERT蛋白表達逐漸下降,西達本胺作用于HL-60細胞48h后,h TERT蛋白相對表達量由0.88±0.09下降至0.39±0.03,AS2O3作用于HL-60細胞48小時后,h TERT蛋白相對表達量由0.88±0.02下降至0.40±0.03。通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析,對照組、不同處理組相互之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。說明單藥西達本胺、AS2O3均能降低h TERT蛋白的表達水平,且呈劑量依賴性。(Fig.7,Fig.8,Table 10,Table 11)4.2不同濃度的西達本胺聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用48h后,低濃度兩藥聯(lián)合h TERT蛋白表達量為0.63±0.05,高濃度兩藥聯(lián)合h TERT蛋白表達量下降到0.17±0.02,隨著藥物濃度的增加,h TERT蛋白表達量逐漸下降,聯(lián)合組與單藥組及對照組比較,h TERT蛋白表達量下降明顯,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。說明西達本胺聯(lián)合AS2O3能夠協(xié)同降低HL-60細胞h TERT蛋白的表達水平。(Fig.9,Table 12)結(jié)論:1西達本胺和三氧化二砷單藥均能對HL-60細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡及抑制增殖的作用,且具有時間、劑量依賴性。2西達本胺和三氧化二砷具有協(xié)同作用,可加強抑制HL-60細胞的效果。3西達本胺、三氧化二砷單藥及聯(lián)合均可抑制HL-60細胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,與h TERTm RNA及h TERT蛋白表達受抑制,下調(diào)端粒酶活性有關(guān),提示h TERTm RNA表達受抑可能是西達本胺和三氧化二砷發(fā)揮腫瘤抑制及促進腫瘤凋亡的作用靶點。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

【參考文獻】

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1 李華棟;楊杰;申忱;劉懷壘;吳佳寧;吳兆利;王春雷;劉耀華;張豫濱;趙世光;;組蛋白去乙酰化酶抑制劑作為放射增敏劑抗腫瘤作用機制研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2014年33期

2 劉仲娜;鐘金城;柴志欣;;端粒和端粒酶在癌癥中的研究進展及意義[J];生命科學(xué)研究;2014年03期

3 李平;;在治療腫瘤領(lǐng)域中組蛋白去乙�；敢种苿┑难芯窟M展[J];中國實用醫(yī)藥;2014年16期

4 李艷瑩;王艷芳;王晶;克曉燕;;西達本胺對人B淋巴瘤細胞株的作用及其機制研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2012年04期

5 董梅;邢鐠元;石遠凱;馮奉儀;;西達本胺在晚期惡性腫瘤患者中的Ⅰ期臨床耐受性研究[J];中國新藥雜志;2009年18期

6 蔣少紅;馬旭東;許云祿;;組蛋白去乙酰化酶抑制藥研究現(xiàn)狀[J];中國新藥與臨床雜志;2008年08期

7 董秀娟;劉文剛;吳書一;趙曉武;;大劑量阿糖胞苷聯(lián)合化療治療急性白血病不良反應(yīng)[J];醫(yī)藥論壇雜志;2008年05期

8 俞慶宏;戰(zhàn)榕;黃豪博;;三氧化二砷對骨髓瘤細胞系U266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機制研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2007年05期

9 黃曉軍;Potentiation of arsenic trioxide induced apoptosis by retinoic acid in retinoic acid sensitive and resistant HL-60 myeloid leukemia cells[J];Chinese Medical Journal;2000年06期

10 王春雷;端粒-端粒酶理論在腫瘤研究中的應(yīng)用[J];軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報;1998年03期

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本文編號：2585456