發(fā)布時間：2020-02-25 00:26

【摘要】：目的從小鼠Lewis肺癌細(xì)胞中分離建立非對稱分裂細(xì)胞系,鑒定其干性特征,并以此細(xì)胞系為模型,初步探討非對稱分裂在腫瘤干細(xì)胞中自我更新中的作用。方法(1)通過8次連續(xù)懸浮聚球,隨后5次單細(xì)胞克隆的方法從小鼠Lewis肺癌細(xì)胞親代細(xì)胞(Lewis Lung Carcinoma Parental cells,LLC-Parental cells)中得到非對稱分裂細(xì)胞系(Lewis Lung Carcinoma Asymmetric Dividing cells,LLC-ASD cells)。(2)通過Brd U標(biāo)記的免疫熒光實驗檢測驗證LLC-ASD cells中細(xì)胞的非對稱分裂。(3)進(jìn)行RT-q PCR、克隆斑成斑實驗、單細(xì)胞瓊脂球形成實驗、單細(xì)胞克隆形成實驗對比兩細(xì)胞系在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)的干性特征。(4)通過同種小鼠肺部移植成瘤實驗和裸鼠皮下成瘤實驗分別對比兩種細(xì)胞系在活體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和成瘤能力。(5)通過RT-q PCR法篩選LLC-ASD cells中候選的非對稱分裂基因。(6)設(shè)計合成目的基因?qū)?yīng)的si RNA,轉(zhuǎn)染LLC-ASD cells,通過RT-q PCR法和WB法驗證si RNA對目的基因的干擾效果。(7)在轉(zhuǎn)染后的LLC-ASD cells中通過Brd U標(biāo)記的免疫熒光實驗檢測目的基因的干擾對非對稱分裂的影響。(8)進(jìn)行克隆斑成斑實驗、單細(xì)胞瓊脂球形成實驗、單細(xì)胞克隆形成實驗檢測目的基因的干擾后的LLC-ASD cells在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)的干性特征。(9)通過裸鼠皮下成瘤實驗明確在LLC-ASD cells中目的基因的干擾與否對活體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果(1)從LLC-Parental cells中得到LLC-ASD cells。(2)Brd U標(biāo)記的免疫熒光實驗證實LLC-ASD cells進(jìn)行非對稱分裂,且非對稱分裂比率達(dá)50%。(3)LLC-ASD cells的克隆斑成斑情況(P0.001)、懸浮球形成數(shù)量(P0.05)、單細(xì)胞克隆形成率(P0.01)均分別高于LLC-Parental cells的。(4)LLC-ASD cells原位種植轉(zhuǎn)移情況較LLC-Parental cells明顯,LLC-ASD cells的裸鼠皮下接種致瘤能力也高于LLC-Parental cells(P0.05)。(5)篩選出了調(diào)控LLC-ASD cells非對稱分裂的候選基因Neuralized1a。(6)以si RNA轉(zhuǎn)染LLC-ASD cells,證實在RNA和蛋白水平上其對Neuralized1a的表達(dá)有良好的抑制效果。(7)抑制Neuralized1a后的LLC-ASD cells中非對稱分裂比率降低。(8)抑制Neuralized1a后的LLC-ASD cells的克隆斑成斑情況(P0.001)、懸浮球形成數(shù)量(P0.001)、單細(xì)胞克隆形成率(P0.01)均分別低于對照組的。(9)抑制Neuralized1a后的LLC-ASD cells的裸鼠皮下接種成瘤能力也低于對照組(P0.05)。結(jié)論成功建立了小鼠Lewis肺癌細(xì)胞非對稱分裂細(xì)胞系,并且它表現(xiàn)出了一定干性特征,并以此細(xì)胞系為模型,證實Neuralized1a調(diào)控其非對稱分裂。
【圖文】：

=（長×寬×寬）/2。分析數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x±s）表示，使用 Graphpad5.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)用 t 檢驗。形態(tài)-Parental cells 基本全部貼壁增殖，異形性明顯且排列緊密過程中偶爾有少量細(xì)胞懸浮增殖（圖 1）。小鼠 LLC-ASD多呈梭形，，少部分圓形；所有梭形細(xì)胞與所有圓形細(xì)胞數(shù)

LLC-ASD 細(xì)胞的鏡下生長形態(tài)（倒置顯微鏡下×100 拍攝）hology characteristic of LLC-ASD cells（×100 by inverted micro記法驗證非對稱分裂導(dǎo)航儀下隨機選擇視野觀察拍照，計數(shù)結(jié)果顯示 LLC-ASD率約為 50%（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：2582581