【摘要】：目的:泛素化是一類重要的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式,其主要作用是特異性介導(dǎo)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白通過蛋白酶體復(fù)合物的降解,同時也可通過非蛋白降解方式改變底物活性,從而在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及DNA損傷修復(fù)等一系列關(guān)鍵生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。泛素連接酶E3(Ubiquitin ligase)在蛋白質(zhì)的泛素化過程中起到關(guān)鍵作用,介導(dǎo)經(jīng)泛素激活酶E1(Ubiquitin-activiting enzyme)活化的泛素從泛素結(jié)合酶E2(Ubiquitin-conjugating enzyme)上轉(zhuǎn)移至底物特定修飾位點(diǎn)。不同的泛素連接酶E3識別不同的底物蛋白,這就決定了其泛素化修飾底物的特異性。RNIG-finger家族中的CUL4A亞組是E3連接酶家族的重要成員,它們參與在翻譯后水平精確調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA修復(fù)以及細(xì)胞凋亡等過程中關(guān)鍵蛋白的降解及活性,參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本項(xiàng)目旨在探討CUL4A在胃癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理資料的相關(guān)性,并通細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步研究其在胃癌化療耐藥過程中的調(diào)控作用及分子機(jī)制。方法:1.提取34例天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治胃癌患者的癌組織和配對正常胃組織全蛋白和RNA,通過Western Blotting和q RT-PCR的方法檢測CUL4A的蛋白和mRNA含量,另收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2003年1月-2009年6月期間手術(shù)的167例胃癌患者的腫瘤組織標(biāo)本,包括腫瘤組織和相應(yīng)的正常胃上皮組織,進(jìn)行下列研究:(1)制備胃癌組織芯片,對所有患者的臨床病理特征進(jìn)行詳統(tǒng)計分析。(2)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色(IHC)方法檢測胃癌組織和正常胃上皮組織中CUL4A的表達(dá)情況。(3)分析CUL4A的表達(dá)與患者的臨床病理學(xué)資料以及預(yù)后之間的關(guān)系。(4)對接受化學(xué)治療的患者進(jìn)行亞組分析。2.應(yīng)用pLKO-Tet-On質(zhì)粒,構(gòu)建CUL4A四環(huán)素誘導(dǎo)敲降型質(zhì)粒,通過酶切法和測序法驗(yàn)證構(gòu)建效果。應(yīng)用慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中包裝病毒,合成具有四環(huán)素誘導(dǎo)沉默CUL4A基因能力的慢病毒顆粒,構(gòu)建攜帶四環(huán)素誘導(dǎo)沉默CUL4A基因的胃癌細(xì)胞株模型。利用Western Blot檢測成功構(gòu)建的上細(xì)胞株模型中,經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)后CUL4A蛋白的表達(dá)情況。3.通過WST-8檢測敲降CUL4A蛋白后胃癌細(xì)胞系對5-FU和順鉑的藥敏結(jié)果。PI法檢測細(xì)胞周期并用Western Blot檢測CUL4A底物蛋白中細(xì)胞周期相關(guān)因子的蛋白水平。應(yīng)用彗星試驗(yàn)檢測敲降CUL4A水平后腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)能力的變化,同時Western Blot檢測CUL4A已知和潛在底物中DNA損傷修復(fù)相關(guān)因子蛋白水平的變化情況。通過Co-IP和競爭性Ubiquitin Assay實(shí)驗(yàn)檢測EME1為CUL4A潛在底物的可能性。同時檢測CUL4A敲降后腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡和運(yùn)動侵襲能力。結(jié)果:1.CUL4A在胃癌組織中的表達(dá)情況:(1)CUL4A陽性細(xì)胞著色定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中;胃癌組織中CUL4A的表達(dá)水平顯著高于配對的胃正常上皮組織(P0.001)。(2)腫瘤患者中CUL4A的相對低表達(dá)與患者腫瘤TNM分期、Lauren分型相關(guān),是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。(3)亞組分析結(jié)果顯示CUL4A的表達(dá)情況與患者化療效果呈正相關(guān),且是化療患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。2.CUL4A表達(dá)降低后,胃癌細(xì)胞對5-FU耐受性增強(qiáng),檢測細(xì)胞周期相關(guān)因子發(fā)現(xiàn),CUL4A底物蛋白P21水平升高,進(jìn)一步將P21敲降后胃癌細(xì)胞對5-FU的耐受性降低;同時CUL4A表達(dá)降低后,胃癌細(xì)胞對順鉑的耐受性增強(qiáng),胃癌細(xì)胞通過增強(qiáng)DNA修復(fù)能力,提高了其對順鉑的耐受能力,檢測DNA修復(fù)相關(guān)因子發(fā)現(xiàn),EME1蛋白水平明顯升高,且與CUL4A敲降時間正相關(guān),其mRNA水平則無明顯改變,Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EME1與CUL4A及其銜接蛋白DDB1均存在直接相互作用,競爭性Ubiquitin Assay實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著功能缺陷性(35)CUL4A的增加,EME1泛素化水平逐漸降低。以上結(jié)果初步證實(shí),在胃癌細(xì)胞中EME1是CUL4A的一個新底物。結(jié)論:1.胃癌組織中CUL4A相對低表達(dá)是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素,且與患者化療抵抗相關(guān)。2.在胃癌細(xì)胞中,CUL4A通過調(diào)控P21及EME1的蛋白水平,影響胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)能力,從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對化療藥物的耐受性。
【圖文】：

胃癌組織與胃上皮組織中CUL4A蛋白及mRNA水平比較

圖 1.1 胃癌組織與胃上皮組織中 CUL4A 蛋白及 mRNA 水平比較定量 PCR 方法檢測組織中 CUL4A mRNA 水平，Western-blotting 方法檢測組織中 CUL4A 蛋白含量。結(jié)果顯示腫瘤組織中 CUL4A 含量明顯高于正常胃上皮組織1.2.1.2 CUL4A 在胃癌組織中的表達(dá)另收集 167 對胃癌腫瘤組織與應(yīng)的正常胃上皮組織進(jìn)行 IHC 染色，結(jié)果顯示 CUL4A 在正常胃上皮組織為低水平表達(dá)或不表達(dá)；而在相應(yīng)的胃癌組織中85 例患者胃癌組織中 CUL4A 呈高表達(dá)，占 50.9%，82 例患者為低表達(dá)，，占 49.1%CUL4A 在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于在非腫瘤組織中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：2581050