發(fā)布時(shí)間：2020-01-31 15:52

【摘要】：研究背景新近的流行病學(xué)資料表明,肺癌已經(jīng)成為惡性腫瘤的首位,嚴(yán)重危害人類的健康。其中80-85%為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),包括腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌等。盡管肺癌的治療手段不斷進(jìn)步,肺癌的生存率仍然很低�；煛⒎暖熑允悄壳爸委熯@些患者的常用手段。腫瘤耐藥是當(dāng)前化療的一個(gè)主要問題,其中涉及許多因素,包括抗癌藥物的效力、腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性等。因此,尋找高效低毒的抗癌藥物成為近年來腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。在NSCLC患者治療中,阿霉素作為一種治療藥物,在一些難治性病例中曾被選用。然而,隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展,新型化療藥物的研制,在肺癌的治療方面,阿霉素逐漸被遺忘。同時(shí),由于兩方面的因素限制了阿霉素的臨床應(yīng)用,一方面由于其骨髓抑制、心肌損傷和心肌毒性等毒副作用;另一方面,阿霉素的耐藥性是一個(gè)重要的因素。正如許多傳統(tǒng)抗癌藥物一樣,如何克服阿霉素的毒副作用和耐藥性是臨床學(xué)者需要迫切解決的難題。關(guān)于阿霉素的研究也從未終止。近年來,中草藥的抗癌作用越來越引起人們的關(guān)注。中草藥是祖國(guó)醫(yī)學(xué)防治疾病的有力武器,人們發(fā)現(xiàn)中藥治療惡性腫瘤,在提高化療效果、改善生存質(zhì)量、減輕臨床癥狀等方面都有很好的效果。已有研究證實(shí),部分中藥與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),能夠有效緩解晚期NSCLC患者癥狀,減少不良反應(yīng),改善病人生活質(zhì)量。紫草素是從中藥紫草的根部提取得到的一種萘醌類化合物,研究發(fā)現(xiàn),其對(duì)肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。關(guān)于紫草素在NSCLC方面的抗癌作用及其涉及的具體機(jī)制尚未完全闡明。目的觀察紫草素對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用以及與阿霉素聯(lián)用后對(duì)A549細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、侵襲、遷移的影響。探討紫草素聯(lián)合阿霉素對(duì)肺癌A549細(xì)胞抗腫瘤作用的機(jī)制。方法1.噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測(cè)不同藥物處理的肺癌A549細(xì)胞抑制率。2.Transwell法檢測(cè)A549細(xì)胞侵襲數(shù)。3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞遷移率。4.集落克隆法檢測(cè)A549細(xì)胞的增殖。5.PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。7.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)。8.二甲基亞砜(Dihydroethidium,DHE)熒光探針檢測(cè)藥物對(duì)A549細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影響。9.腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平變化。10.熒光顯微鏡下觀察線粒體膜勢(shì)能變化。11.流式細(xì)胞儀測(cè)定A549細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度。12.活細(xì)胞工作站觀察細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度。13.Westem-blot檢測(cè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.0.8μmol/L以上濃度的紫草素對(duì)A549細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制作用,因此我們選擇0.8μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物起始濃度。2.0.8μmol/L以上濃度紫草素作用于A549細(xì)胞48h以后,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞間距增大,胞體變圓、縮小,出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。3.與對(duì)照組比較,不同濃度紫草素處理組A549細(xì)胞侵襲數(shù)目、遷移率降低,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組及單用藥物組相比,紫草素聯(lián)合阿霉素組侵襲細(xì)胞數(shù)目、遷移率顯著減低。與對(duì)照組比較,各組MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均下調(diào),其中紫草素與阿霉素聯(lián)合組MMP-2、MMP-9表達(dá)水平最低。4.將不同濃度的紫草素、阿霉素分別處理A549細(xì)胞24h及48h,MTT結(jié)果顯示紫草素和阿霉素均能以時(shí)間及劑量依賴性方式抑制肺癌A549細(xì)胞增殖,與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而紫草素和阿霉素之間對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制無明顯差異。用紫草素和阿霉素共同處理的A549細(xì)胞比單獨(dú)應(yīng)用紫草素或者阿霉素處理細(xì)胞顯示出較少的活力,細(xì)胞存活率為53.77%,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.紫草素與阿霉素合用組對(duì)肺癌A549細(xì)胞的集落克隆形成率明顯減少。6.紫草素與阿霉素聯(lián)合用藥能有效誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,其誘導(dǎo)的凋亡率明顯高于對(duì)照組、紫草素組、阿霉素組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。7.紫草素聯(lián)合阿霉素組較阿霉素組S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加,G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少,兩藥聯(lián)合對(duì)細(xì)胞周期的影響最明顯。8.紫草素能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。9.經(jīng)過不同藥物處理后,各組A549細(xì)胞內(nèi)ATP水平較對(duì)照組均有所降低,紫草素組與阿霉素組ATP下降率分別達(dá)到80%和81%,而紫草素與阿霉素聯(lián)合處理組A549細(xì)胞ATP水平下降最明顯,達(dá)到60%。10.紫草素和阿霉素聯(lián)合處理組A549細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低明顯。11.經(jīng)過不同的藥物處理,流式細(xì)胞儀顯示紫草素與阿霉素聯(lián)合處理組,A549細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度較對(duì)照組、阿霉素組均明顯升高,提示紫草素能夠顯著增加A549細(xì)胞中阿霉素的水平。12.活細(xì)胞工作站顯示在分別接受紫草素、阿霉素處理后,能明顯提升A549細(xì)胞內(nèi)阿霉素的熒光強(qiáng)度。13.Westem-blot顯示:在空白對(duì)照組多藥耐藥蛋白1(multi-drug resistance protein1,MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)蛋白水平均有不同程度的表達(dá)。經(jīng)過紫草素或者阿霉素處理以后,這些耐藥蛋白的表達(dá)水平均較前下降,以紫草素和阿霉素聯(lián)合處理組下降最為明顯。結(jié)論1.不同濃度的紫草素對(duì)A549細(xì)胞增殖具有抑制作用;紫草素能夠增強(qiáng)阿霉素抑制A549細(xì)胞增殖作用。2.不同濃度的紫草素能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象;紫草素能夠增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。3.紫草素能夠抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移作用;紫草素能夠增強(qiáng)阿霉素抑制肺癌A549細(xì)胞的侵襲和遷移作用。紫草素增強(qiáng)阿霉素抑制肺癌A549細(xì)胞的侵襲、遷移能力可能與抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。4.紫草素能夠干擾肺癌A549細(xì)胞周期,誘導(dǎo)凋亡。5.紫草素能夠增強(qiáng)阿霉素破壞A549細(xì)胞線粒體膜的勢(shì)能,抑制ATP的產(chǎn)生,促進(jìn)A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。6.紫草素能夠通過降低阿霉素外排,提高阿霉素在A549細(xì)胞中聚集濃度。7.紫草素能夠增強(qiáng)阿霉素抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。
【圖文】：

紫草素的分子結(jié)構(gòu)

圖 2.紫草素對(duì)肺癌 A549 細(xì)胞的增殖抑制作用gure 2. Effect of shikonin inhibited the proliferation of lung cancer A549 cellsCompared with 0μmol/LSHK group, * P<0.05, ** P<0.01同藥物處理組 A549 細(xì)胞鏡下形態(tài)觀察ol/L 以上濃度紫草素作用于 A549 細(xì)胞 48h 以后，出現(xiàn)明顯的細(xì)為：細(xì)胞數(shù)量明顯減少，，細(xì)胞間距增大，胞體縮小、變圓 (圖
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2575081