發(fā)布時間：2020-01-29 22:53

【摘要】：背景：我們以往研究證實：來源于腫瘤細胞、富含短壽蛋白的自噬小體—DRibbles疫苗能夠誘導具有抗腫瘤效應的免疫應答,其中,樹突細胞交叉提呈DRibbles中所包含的泛素化蛋白是其主要免疫學機制。在本研究中,我們擬從腫瘤細胞中直接提取泛素化蛋白并探討其作為一種新型腫瘤疫苗的可行性。方法：1.募集泛素化蛋白：采用萬科預處理腫瘤細胞EL4和B16-F10,得到細胞裂解液后用兩種不同的泛素結合蛋白TUBEs (tandem ubiquitin binding entities)和Vx3(A7)蛋白募集腫瘤細胞的泛素蛋白。SDS-PAGE和western blotting檢測獲取的泛素化蛋白。2.泛素化蛋白誘導腫瘤特異性免疫應答的檢測：應用不同劑量的泛素蛋白通過淋巴結或皮下免疫C56BL/6小鼠,并以DRibbles、去除泛素化蛋白的腫瘤細胞裂解液和完整的腫瘤細胞裂解液作為對照。收獲免疫小鼠的脾臟細胞,體外用滅活的腫瘤細胞再刺激,ELISA方法測定培養(yǎng)上清中的IFN-γ,并用胞內染色測定細胞內IFN-γ。3.泛素化蛋白誘導抗腫瘤作用的檢測：在C57BL/6小鼠中建立EL4和B16-F10二種腫瘤模型,通過淋巴結或皮下注射泛素蛋白,PBS,Vx3(A7)蛋白,完整的細胞裂解液和去除Ub蛋白的細胞裂解液,檢測上述不同免疫在同源或異源腫瘤模型中的抗腫瘤效果,觀察不同組腫瘤模型中腫瘤的生長狀況。結果：1.結果顯示：相比于TUBEs, Vx3(A7)蛋白能夠從腫瘤細胞裂解液中募集更多的泛素化蛋白。用Vx3蛋白能夠有效的從細胞裂解液中分離K63蛋白�；谶@些結果,Vx3蛋白被用于純化泛素化蛋白,并檢測他們是否能夠誘導特異性抗腫瘤免疫應答及其抗腫瘤作用。2.結果顯示,從泛素化蛋白免疫后的小鼠中分離的淋巴細胞經滅活的腫瘤細胞刺激后能夠以劑量依賴的方式分泌IFN-γ。初次免疫采用淋巴結注射相比于皮下注射能偶誘導更高的IFN-γ量。泛素化蛋白組IFN-γ的分泌量明顯高于完整的細胞裂解液和去除泛素化蛋白的細胞裂解液。更有趣的是,當用從EL4或B16-F10細胞募集的泛素化蛋白免疫小鼠并分離淋巴細胞,用滅活的B16-F10或EL4細胞刺激也能夠產生高水平的IFN-γ。3.抗腫瘤實驗顯示：泛素化蛋白與去除Ub蛋白的細胞裂解液和腫瘤細胞裂解液相比,經過三次免疫后誘導的免疫應答能夠顯著抑制荷瘤小鼠(EL4或B16-F10腫瘤模型)的腫瘤生長。而且EL4或B16-F10細胞來源泛素化蛋白誘導的免疫應答對B16-F10或EL4細胞的生長有一定的交叉保護作用。結論：1.與TUBEs相比,Vx3蛋白能夠更有效地,從封閉蛋白酶體降解途徑的腫瘤細胞裂解液中募集泛素化蛋白。2.與腫瘤細胞裂解液和去除泛素化蛋白的裂解液相比,泛素化蛋白疫苗能誘導更強的腫瘤特異性免疫應答。3.泛素化蛋白疫苗對EL4或B16-F10腫瘤具有明顯的治療效果,并且在同種異體腫瘤中具有交叉保護作用。
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.51
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本文編號：2574502