【摘要】：結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類生存消化道惡性腫瘤,在我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,而結(jié)直腸癌五年生存率仍較低,因此開發(fā)有效的化療藥物具有重要意義。亞硒酸鈉可以導(dǎo)致癌細(xì)胞周期阻滯,可有效誘導(dǎo)白血病、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等多種癌細(xì)胞凋亡,可有效治療結(jié)直腸癌、前列腺癌等異位移植瘤裸鼠,輔助治療非霍奇金淋巴瘤病人可顯著增強(qiáng)化療療效,但具體分子機(jī)制仍不清楚。本課題對亞硒酸鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行了研究,提供了潛在的聯(lián)合治療靶點(diǎn),揭示了RIP1泛素化在結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中的作用及調(diào)控機(jī)制,建立了結(jié)直腸癌異位移植瘤裸鼠模型,評估了亞硒酸鈉的毒性及治療效果并通過免疫組織化學(xué)等方法在腫瘤組織驗證了細(xì)胞學(xué)水平上的發(fā)現(xiàn)。本研究選用結(jié)直腸癌HCT116及SW480細(xì)胞和亞硒酸鈉為研究對象,對RIP1泛素化在亞硒酸鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。通過免疫共沉淀實(shí)驗及免疫熒光實(shí)驗發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉誘導(dǎo)RIP1上Lys63(賴氨酸63型)多聚泛素鏈被移除,使得RIP1與Caspase8、FADD形成復(fù)合物激活Caspase8 。同時我們通過免疫熒光與Western blot實(shí)驗發(fā)現(xiàn),亞硒酸鈉通過對RIP1上Lys63型多聚泛素鏈修飾的調(diào)節(jié)導(dǎo)致IKK/NFκB通路失活,從而下調(diào)了Caspase8的抑制蛋白Flip,進(jìn)一步促進(jìn)了Caspase8的激活。通過免疫熒光及Western blot實(shí)驗對下游通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉誘導(dǎo)Caspase8激活在早期凋亡中除直接起始外源凋亡通路外,Caspase8通過切割Bcl-2家族蛋白Bid,導(dǎo)致tBid從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體,從而誘導(dǎo)線粒體內(nèi)源凋亡通路。本研究采用RIP1抗體進(jìn)行免疫共沉淀后孵育Lys63型多聚泛素鏈抗體率先對位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中RIP1的泛素化修飾水平進(jìn)行了研究,且發(fā)現(xiàn)RIP1上Lys63型多聚泛素鏈修飾具有對泛素蛋白修飾的數(shù)目選擇偏好。此外,本研究結(jié)果提示化療藥物誘導(dǎo)的凋亡可能與死亡配體受體起始的外源凋亡通路有類似途徑,為化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理研究提供新的思路。進(jìn)一步研究揭示了亞硒酸鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡中RIP1上Lys63型多聚泛素鏈修飾的調(diào)控機(jī)制。Western blot結(jié)果顯示亞硒酸鈉作用后泛素連接酶cIAP1及cIAP2明顯下調(diào)而去泛素化蛋白酶CYLD顯著上調(diào)。過表達(dá)cIAP1后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗發(fā)現(xiàn)RIP1上Lys63型多聚泛素鏈修飾水平明顯上調(diào),從而下調(diào)硒誘導(dǎo)RIP1與Caspase8、FADD形成復(fù)合物水平,Western blot及流式細(xì)胞儀檢測到過表達(dá)cIAP1降低了亞硒酸鈉誘導(dǎo)的凋亡。而另一方面,干擾cIAP1及cIAP2或過表達(dá)CYLD則顯著下調(diào)RIP1上Lys63型多聚泛素鏈修飾,促進(jìn)RIP1與Caspase8、FADD形成復(fù)合物,上調(diào)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的凋亡。此外,我們通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(ChIP)揭示了亞硒酸鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中LEF1上調(diào)CYLD表達(dá)水平的機(jī)制,首次發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中LEF1對CYLD的轉(zhuǎn)錄抑制作用,及亞硒酸鈉誘導(dǎo)LEF1對CYLD的轉(zhuǎn)錄抑制的解除。本研究在細(xì)胞學(xué)水平的基礎(chǔ)上,建立了HCT116異位移植瘤裸鼠模型,發(fā)現(xiàn)1mg/kg/d及2mg/kg/d的亞硒酸鈉對HCT116異位移植瘤小鼠有良好的治療效果而無明顯毒副性。采用裸鼠腫瘤組織通過免疫組織化學(xué)和Western blot實(shí)驗方法驗證了細(xì)胞學(xué)水平的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)2mg/kg/d的亞硒酸鈉通過cIAP、CYLD通路激活Caspase8誘導(dǎo)裸鼠鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡,得到與細(xì)胞學(xué)水平上一致的實(shí)驗結(jié)果。本研究課題首次揭示了Lys63型多聚泛素鏈在亞硒酸鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡中的作用及調(diào)控機(jī)制。為亞硒酸鈉治療結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

＂Ｖ￣＾ＯＯＨ逡逑圖２亞砸酸鹽吸收及代謝示意圖２－１９逡逑Ｆｉｇ２邋Ｍｏｄｅｌ邋ｆｏｒ邋ｓｅｌｅｎＵｅ邋ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｍｅ化ｈｏｌｉｓｍ．逡逑除了能有效誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，，亞砸酸鋼還被報道能有效治療前列腺癌、逡逑．邐結(jié)直腸癌等多種癌癥的異位移植瘤小鼠。研究表明亞砸酸鋼比其他有機(jī)曬補(bǔ)充劑具逡逑有更好的治療ＰＣ３前列腺癌原位移植瘤的效果，服用亞砸酸鋼能顯著的減少原位腫逡逑瘤生長及向腹膜后淋己結(jié)的轉(zhuǎn)移２２。研究還發(fā)現(xiàn)亞砸酸鋼能增強(qiáng)順巧治療小鼠卵巢逡逑癌異位移植瘤的效果２３。此外，有為期五年的研究對嚴(yán)重缺砸地區(qū)的人群給予口服逡逑１５ｐｐｍ亞砸酸鋼，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌降低４３％２４。認(rèn)為亞砸酸鋼選擇性殺傷癌細(xì)胞的逡逑原因可能是癌基因異常激活的細(xì)胞更容易在活性氧等的誘導(dǎo)下啟發(fā)程序性細(xì)胞死逡逑ｔ而正常的細(xì)胞僅生長分裂受到影響。逡逑２．結(jié)直腸癌逡逑結(jié)直腸癌多發(fā)于直腸和乙狀結(jié)腸，是嚴(yán)重威脅人類生存的消化道惡性腫瘤，在逡逑５０歲Ｗ上人群中發(fā)病率顯著上升。２０１４年全球約７００．０００患者死于結(jié)直腸癌，致死逡逑率躍居第二，結(jié)直腸癌患者的五年生存率僅約４０％２５。結(jié)直腸癌在發(fā)達(dá)國家高發(fā)，但逡逑隨著生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變

計結(jié)果顯示，２０１１年我國結(jié)直腸癌發(fā)病率居所有癌癥發(fā)病率第四位，結(jié)直腸癌死亡逡逑率在所有癌癥死亡率第五位，而男性比女性高發(fā)，城市居民比農(nóng)村居民高發(fā)，隨年逡逑齡增長發(fā)病率顯著上升（圖３）邋２６。逡逑８逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34


本文編號：2573729