【摘要】：目的癌癥是人類所面臨的重大疾病,盡管過去的這些年對癌癥的研究做出了很大的努力,并取得了許多重要的成果,但是治愈癌癥仍然還是一個臨床疾病治療中的難題;特別是癌癥的耐藥性,人類癌細(xì)胞在化療過程中產(chǎn)生的藥物抵抗是人類癌癥治療過程中所面臨的主要障礙。具有不同特性的抗癌藥物的聯(lián)合使用,能克服癌細(xì)胞的耐藥性,是一種有希望的抗癌治療策略。棉酚(GOS)是一種天然BH3模擬物,它具有抗細(xì)胞增殖和促細(xì)胞凋亡的雙重活性,是潛在的抗腫瘤藥物;但是它在誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞發(fā)生死亡的效應(yīng)非常有限。組蛋白去乙�；�(HDAC)抑制劑是一類新型的抗癌藥物,通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;HDAC抑制劑與其它抗癌藥物聯(lián)用能明顯地促進(jìn)后者的抗癌效應(yīng)。以往的研究顯示,HDAC抑制劑丙戊酸(VPA)能夠協(xié)同性增強(qiáng)GOS對人前列腺癌細(xì)胞DU145的細(xì)胞毒性。然而,VPA和GOS協(xié)同作用的潛在分子機(jī)制還不清楚。另外,這種協(xié)同作用是否具有普遍性、其它HDAC抑制劑是否也具有同樣的協(xié)同效應(yīng)、體內(nèi)效應(yīng)如何等一系列問題也未解決。本研究主要以黑素瘤A375、宮頸癌He La和前列腺癌PC-3等人類腫瘤細(xì)胞為模型,旨在進(jìn)一步探索GOS和VPA聯(lián)合用藥協(xié)同抑制多種類型人類腫瘤細(xì)胞生長的作用機(jī)制,并在腫瘤動物模型上進(jìn)行驗(yàn)證。方法首先在細(xì)胞水平上,以WST-1法檢測GOS和VPA分別對人類黑素瘤A375、宮頸癌He La和前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的影響。接著利用免疫印跡法檢測不同藥物處理對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬及信號通路等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。隨后采用免疫熒光顯微技術(shù)觀察GOS和VPA處理后細(xì)胞內(nèi)LC3和LAMP2的共定位,檢測自噬體和溶酶體的融合情況。然后利用特異性抑制劑和小分子干擾RNA(si RNA)技術(shù)研究相關(guān)蛋白和信號通路在GOS+VPA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的作用。再以流式細(xì)胞術(shù)檢測GOS和VPA處理對細(xì)胞周期分布的影響。并利用實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)(q PCR)分析藥物處理對Bim和Fas L等基因m RNA表達(dá)水平的影響。最后在動物模型上,通過皮下移植人黑素瘤A375細(xì)胞,并用GOS和VPA處理觀察聯(lián)合用藥對體內(nèi)腫瘤生長的影響。結(jié)果細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,無毒性劑量的VPA能明顯促進(jìn)GOS對A375、He La和PC-3的細(xì)胞毒性,表現(xiàn)出協(xié)同作用。免疫印跡和顯微鏡觀察顯示,GOS+VPA能夠明顯地激活caspase-3,并能誘導(dǎo)PARP剪切和細(xì)胞核碎裂,而單獨(dú)GOS或VPA則沒有作用,說明GOS+VPA通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其協(xié)同作用;辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、HDAC6抑制劑tubacin和尼克酰胺(Nico)等其他HDAC抑制劑與GOS聯(lián)用不能誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞自噬似乎不參與GOS+VPA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,因?yàn)榧?xì)胞自噬的抑制對GOS+VPA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡沒有顯著影響。GOS+VPA協(xié)同性誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡似乎與組蛋白的乙�；綗o關(guān),但是與cyclin A2和Akt信號的下調(diào)具有很強(qiáng)的相關(guān)性。免疫印跡結(jié)果表明,GOS與VPA聯(lián)合處理明顯降低了cyclin A2的表達(dá)水平,因而抑制了Akt信號,進(jìn)而導(dǎo)致FOXO3a去磷酸化而被激活,使得受其調(diào)控的靶基因(包括促細(xì)胞凋亡的Fas L、Trail和Bim)表達(dá)上調(diào);GOS+VPA處理也明顯下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin的表達(dá),激活caspase-8和caspase-9。由此,GOS與VPA聯(lián)用同時激活了腫瘤細(xì)胞的外源性和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路。si RNA敲低實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FOXO3a敲低減弱了Fas L和Bim上調(diào),也減輕了GOS+VPA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),蛋白酶體抑制劑MG132能夠明顯減弱GOS+VPA處理引起的cyclin A2下調(diào),阻止Akt和FOXO3a的去磷酸化,進(jìn)而降低了腫瘤細(xì)胞的凋亡水平。最后,在裸鼠腫瘤移植模型中,GOS或VPA單獨(dú)無明顯抑瘤作用,而GOS+VPA能顯著抑制A375移植腫瘤的生長,表明了GOS和VPA聯(lián)用在體內(nèi)也具有協(xié)同抗腫瘤效果。結(jié)論上述研究結(jié)果表明,VPA和GOS能夠協(xié)同地誘導(dǎo)A375、He La和PC-3等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,沒有明顯的腫瘤細(xì)胞類型特異性;而其他HDAC抑制劑與GOS聯(lián)用則無明顯協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。GOS和VPA聯(lián)用能有效抑制cyclin-A2/Akt/FOXO3a信號通路,進(jìn)而激活內(nèi)源性和外源性細(xì)胞凋亡通路,從而協(xié)同地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。GOS和VPA聯(lián)合處理導(dǎo)致了cyclin A2的降解,而cyclin A2的降解一定程度上是通過泛素-蛋白酶體途徑引起的。此外,GOS和VPA聯(lián)用在體內(nèi)也具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)�？傊�,這些研究結(jié)果說明,GOS和VPA聯(lián)合使用可能是一種新的潛在的癌癥治療手段,為治療化療抵抗性人類癌癥提供了一種新的策略。
【圖文】：

暨南大學(xué)博士學(xué)位論文群體中本來就存在耐藥的細(xì)胞，藥物處理后對其進(jìn)行了篩選，，從而產(chǎn)生耐藥另一方面，腫瘤細(xì)胞也會隨著藥物的不斷處理而發(fā)生進(jìn)化，從而對藥物產(chǎn)生[11]另外，上皮樣腫瘤細(xì)胞到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力和抵抗特性[12]T 細(xì)胞在癌癥免疫監(jiān)視和腫瘤殺傷中起著重要的作用，臨床通物增強(qiáng)抗腫瘤 T 細(xì)胞的反應(yīng)來治療癌癥已經(jīng)取得了令人鼓舞的結(jié)果 然而，來的研究表明，腫瘤相關(guān)基因（如 PTEN BRAF）的突變會導(dǎo)致 T 細(xì)胞免疫的抵抗，但當(dāng)免疫治療藥物和突變基因抑制劑聯(lián)合處理后會顯著改善免疫治效果[13, 14]，提示藥物聯(lián)合使用是克服癌癥化療抵抗的一種有效手段 由于細(xì)胞的異質(zhì)性和常常存在多基因突變的特點(diǎn)，所以幾種藥物的聯(lián)合使用往往單藥療效好 因此具有不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物的聯(lián)合使用代表了一種強(qiáng)的腫瘤治療策略

7圖 1.2 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的基本過程[47]Figure 1.2 The processes of apoptosis and autophagy. a The apoptosis pathways: intrinsic andextrinsic apoptosis. Intrinsic apoptosis is marked by one central event - mitochondrial outermembrane permeabilization (MOMP) - which results in the release of cytochrome c from themitochondrial intermembrane space. Cytosolic cytochrome c subsequently triggers the assemblyof the apoptosome. Then directly activate other caspases, such as caspase-3. Extrinsic apoptosisoccurs in response to ligation of the so-called death receptors, including Fas or TNF-relatedapoptosis-inducing ligand receptor (TRAILR). b The core autophagy pathway starts with theformation of an isolation membrane (also called phagophore). A portion of cytoplasm is enclosedby a phagophore or isolation membrane to form an autophagosome. The outer membrane of theautophagosome subsequently fuses with the lysosome, and the internal material is degraded in theautolysosome.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-36


本文編號：2569694