【摘要】：研究背景食管癌(Esophageal carcinoma)是一種臨床常見的惡性腫瘤,起源于食管上皮,主要的組織類型為鱗癌和腺癌。在我國90%的食管癌為鱗狀細胞癌,腺癌只占不到10%。男性患病率高于女性,多在40歲以上發(fā)病。由于人食管解剖結(jié)構(gòu)的特點,其預(yù)后較差,整體生存率低于10%,術(shù)后5年生存率約20%-40%。我國是食管癌高發(fā)區(qū)之一,同時也是高死亡率國家之一,大約每年有15萬人死于食管癌,占癌癥總死亡率的23.53%。食管癌的早期癥狀多不明顯,一旦出現(xiàn)典型臨床癥狀,多數(shù)錯過了最佳治療時機。目前認為食管癌是一種多因素作用、多基因相關(guān)、多階段發(fā)展的疾病,盡管眾多學者做了大量研究,仍未闡明其確切發(fā)病機制。鑒于其生存率低,預(yù)后差,因此早期識別食管癌就顯得尤為重要。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的主要作用機制之一。EMT是具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換成能夠在細胞基質(zhì)間自由移動的細胞過程,其轉(zhuǎn)變的主要特征在于原來的細胞失去上皮細胞特性,轉(zhuǎn)而表達間質(zhì)細胞的特性。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中,癌細胞通過EMT實現(xiàn)對周圍組織的浸潤；到達種植部位后,癌細胞通過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-epithelial transition, MET)最終形成與原發(fā)灶在形態(tài)結(jié)構(gòu)上相似的轉(zhuǎn)移灶�；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)是一組由結(jié)締組織分泌依賴Zn2+的能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶家族,到目前為止共發(fā)現(xiàn)28個成員。目前研究表明MMP參與了血管基底膜的降解及細胞外基質(zhì)的重塑過程,從而導致內(nèi)皮細胞能夠侵襲、轉(zhuǎn)移到周圍組織并促進腫瘤血管的生成。正是這一過程導致了腫瘤遠處轉(zhuǎn)移率的增高,也是促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。ZEB(Zinc finger E-box binding protein)即E盒鋅指結(jié)合蛋白,其家族成員包括ZEB1 (zinc-finger E-box binding homeobox 1)和ZEB2 (zinc-finger E-box binding homeobox 2)2種。ZEB2能夠誘導腫瘤細胞向具有高侵襲、高轉(zhuǎn)移能力的間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變,從而使腫瘤細胞喪失上皮細胞特性的標志物,獲得間葉細胞特性的標志物。另有研究表明ZEB2是通過與靶基因啟動子區(qū)的E-box結(jié)合,從而抑制上皮細胞特性標志物如細胞間E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(claudin)、間隙連接蛋白(connexin)、橋粒斑蛋白(desmoplakin)等靶基因的轉(zhuǎn)錄,導致上皮細胞極性的喪失和細胞間連接的減少。與此同時,過高表達的ZEB2可以促進間質(zhì)性標志物如波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、MMP的表達,誘導EMT的發(fā)生,從而促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。Hedgehog信號通路包括配體Hh、胞膜受體Ptch和Smo、下游轉(zhuǎn)錄因子Gli、Hip(負性調(diào)節(jié)因子)和SuFu (Fu抑制因子)�？缒さ鞍譖tch和Smo形成受體復合物與Hedgehog結(jié)合后,Smo構(gòu)象發(fā)生改變,解除了Ptch對其的抑制,Smo進入胞質(zhì),將信號下傳,激活轉(zhuǎn)錄因子Gli,后者進入細胞核,啟動Gli1, Wnt和EGF等目的基因的表達。SuFu通過結(jié)合Gli,阻止Gli激活下游靶基因,從而導致Hedgehog通路的抑制。研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路在包括皮膚基底細胞癌、小細胞肺癌、成神經(jīng)管細胞瘤、前列腺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤組織中出現(xiàn)異常激活。有研究表明,Gli1通過上調(diào)MMP11參與了乳腺癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。另有研究表明,Hedgehog信號通路中Gli1通過調(diào)節(jié)ZEB2促進EMT發(fā)生、發(fā)展。EMT是否參與了食管癌的的發(fā)生、發(fā)展,并且MMP11、ZEB2是否參與其中均未可知；Hedgehog信號通路是否對食管癌有調(diào)控作用,具體調(diào)控途徑如何亦未可知。本部分采用免疫組化的方法檢測Gli1、MMP11、ZEB2在食管癌組織中的表達,并探討其與臨床因素的相關(guān)性。研究目的檢測人食管鱗癌、癌旁組織和正常組織中Gli1、MMP11、ZEB2蛋白的表達水平,并探究它們和食管癌患者的年齡、性別、臨床分期等臨床病理因素的關(guān)系,為臨床診斷食管鱗癌尋求新的思路。研究方法運用免疫組化的方法檢測72例食管鱗癌組織及其對應(yīng)的72例癌旁組織(距腫塊邊緣5cm以上)和18例正常的食管組織中Gli1、MMP11、ZEB2蛋白的表達水平。應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件比較Gli1、MMP11、ZEB2蛋白表達量與食管鱗癌組織、癌旁組織和正常組織的臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果1、Gli1在食管鱗癌組織的陽性表達率為55.6%，，癌旁組織為13.9%，食管正常組織中為11.1%,組間表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Gli1在癌旁組織和食管正常組織中的表達均顯著低于鱗癌組織(P0.05), Gli1在癌旁組織和食管正常組織中表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、Gli1陽性表達率在Ⅰ期和Ⅱ期遠低于Ⅲ期和Ⅳ期(P0.05),T1期和T2期遠低于T3期和T4期(P0.05),無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的遠低于轉(zhuǎn)移的(P0.05),但其表達與年齡、性別、腫瘤位置、直徑及分化程度無關(guān)(P0.05)。3、MMP11在食管鱗癌組織的陽性表達率為69.4%,癌旁組織為25.0%,食管正常組織中為22.2%,組間表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。MMP11在癌旁組織和正常組織中的表達均低于鱗癌(P0.05), MMP11在癌旁組織和食管正常組織中表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、MMP11陽性表達率在Ⅰ期和Ⅱ期遠低于Ⅲ期和Ⅳ期(P0.05),T1期和T2期遠低于T3期和T4期(P0.05),無淋巴轉(zhuǎn)移的遠低于轉(zhuǎn)移的(P0.05),但其表達與年齡、性別、腫瘤位置、直徑及分化程度無關(guān)(P0.05)。5、ZEB2蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達率為60.5%,癌旁組織為14.0%,食管正常組織中為8.3%,組間表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ZEB2在食管癌旁組織和正常組織中的表達均顯著低于食管鱗癌組織(P0.05), ZEB2在癌旁組織和正常食管組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。6、ZEB2蛋白陽性表達率在Ⅰ期和Ⅱ期遠低于Ⅲ期和Ⅳ期(P0.05),T1期和T2期遠低于T3期和T4期(P0.05),無淋巴轉(zhuǎn)移的遠低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P0.05),但其表達和患者的年齡、性別與腫瘤的位置、直徑及分化程度無關(guān)(P0.05)。7、Gli1、MMP11、ZEB2的表達在食管鱗癌中呈正相關(guān)。結(jié)論1、Gli1、MMP11、ZEB2與食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān),與患者的年齡、性別、腫瘤的位置、直徑、分化程度無關(guān)。2、Gli1、MMP11、ZEB2參與了食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程,較高表達的Gli1、MMP11、ZEB2可能是促進食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的因素之一。3、聯(lián)合檢測Gli1、MMP11、ZEB2有助于判斷食管鱗癌的惡性程度,可為臨床診斷及治療提供一定的理論參考依據(jù)。研究背景EMT的發(fā)生、發(fā)展與多種蛋白分子、基因及微環(huán)境等有關(guān),涉及到多個相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控,其中包括P13K/AKT信號通路、TGF-β信號通路、Wnt信號通路和Notch信號通路等,并且受到多種生長因子的調(diào)節(jié),如上皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子等,與上皮細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后,激活細胞內(nèi)的信號通路,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導基因的表達,最終促進EMT的發(fā)生。環(huán)巴胺(Cyclopamine)是一種提取自山黎蘆的甾體類生物堿,通過特異性地與Smo結(jié)合導致Hedgehog信號通路失活,使用環(huán)巴胺處理人腫瘤細胞系,或者用小鼠異種移植體培養(yǎng)的腫瘤活組織之后,在體內(nèi)、外對多種腫瘤細胞的生長均有明顯的抑制作用。本部分檢測Hedgehog、EMT在食管癌細胞中的表達,采用環(huán)巴胺抑制Hedgehog后觀察Hedgehog、EMT的變化,研究二者之間是否具有一定的相關(guān)性。研究目的檢測人食管癌細胞及環(huán)巴胺干預(yù)后Gli1mRNA、MMP11mRNA、ZEB2mRNA的表達水平,探討Hedgehog和EMT在食管癌細胞中的相關(guān)性,并驗證環(huán)巴胺的治療作用。研究方法1、MTT法檢測環(huán)巴胺的時間-劑量-效應(yīng)曲線及中效濃度。2.Real-time PCR檢測人食管癌細胞EC9706加入環(huán)巴胺前后Gli1mRNA、 MMP11mRNA、ZEB2mRNA的表達水平。結(jié)果1、環(huán)巴胺處理EC9706后可以抑制細胞增殖、生長,細胞由飽滿的梭形貼壁生長變?yōu)檩喞磺宓膱A鈍半貼壁狀態(tài),在一定濃度下抑制率隨濃度增高而增大且具有相關(guān)性,而且干預(yù)的時間越長,其抑制率也隨之加大,在相當?shù)姆秶鷥?nèi)具有藥物作用時間和作用濃度依賴性。作用2天后的IC5o為16±1.87μmol/L。2、環(huán)巴胺作用于EC9706后Gli1mRNA、MMP11mRNA、ZEB2mRNA表達均下調(diào)。結(jié)論1、環(huán)巴胺可以抑制人食管癌細胞EC9706的增殖。2、Hedgehog信號通路可能與MMP11、ZEB2具有一定的相關(guān)性,可能共同參與了食管癌細胞的增殖。3、環(huán)巴胺可能對食管癌具有治療作用。
【圖文】：

食管癌細胞EC9706(加環(huán)巴胺前)

環(huán)巴胺對EC9706細胞的ICso
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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本文編號：2567709