【摘要】：胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,是嚴(yán)重危害我國人民健康的重大疾病之一。由于早期癥狀不典型,確診時多處于中晚期,轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差、化療敏感性低,是制約胃癌患者提高生存率的重要因素。目前認(rèn)為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是包括胃癌在內(nèi)的多種來源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要生物學(xué)過程,已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點(diǎn)。開發(fā)能夠抑制胃癌EMT的抗腫瘤新藥,對于防治胃癌的轉(zhuǎn)移,改善患者預(yù)后具有重要的意義。南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)為衛(wèi)矛科南蛇藤屬落葉木質(zhì)藤本植物,是我國重要的藥用植物,其莖、根、葉和果均可入藥,具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)止痛、活血解毒等功效。近年來,南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(C. orbiculatus ethyl acetate extract, COE)的抗腫瘤作用已被廣泛證實(shí),但以往的研究多集中在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡,抑制腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等方面,關(guān)于針對其在腫瘤EMT方面的研究甚少。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)COE可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力,然而COE是否具有抑制胃癌EMT發(fā)生的作用及其確切機(jī)制尚不清楚。本課題主要在前期研究的基礎(chǔ),利用轉(zhuǎn)錄生長因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生EMT過程,建立EMT模型。研究COE對TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT發(fā)生的抑制作用及其可能的分子機(jī)制。建立裸鼠胃癌皮下移植瘤和腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型,研究COE在體內(nèi)對胃癌生長、轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制。通過本課題的研究,進(jìn)一步闡明了COE抑制胃癌EMT的作用及相關(guān)分子機(jī)制,為開發(fā)新型抗胃癌藥物提供新的策略和理論依據(jù)。本課題共分為三部分研究內(nèi)容。第一部分南蛇藤提取物抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生目的：觀察COE對TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌SGC-7901細(xì)胞EMT發(fā)生的影響；并對SGC-7901細(xì)胞在COE處理前后的樣本進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,尋找COE抑制胃癌EMT發(fā)生的可能作用靶點(diǎn)。方法：體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞,給予不同濃度(2.5,5, 10ng/mL)的TGF-β1誘導(dǎo)24 h后,觀察其形態(tài)變化,并采用Western blot技術(shù)檢測TGF-β1對SGC-7901細(xì)胞EMT的影響,以確定建立EMT模型時TGF-β1的最佳濃度。不同濃度(10,20,40,80,160,320μg/mL)的COE對作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后,MTT法檢測COE對細(xì)胞生長增殖的影響,以確定后續(xù)實(shí)驗中COE的濃度。不同濃度(5,10,20μg/mL)的COE作用于TGF-β1 (10ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24 h后,Western blot和Transwell小室實(shí)驗分別檢測細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達(dá)以及細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化,從而明確COE對胃癌細(xì)胞EMT發(fā)生的抑制作用。COE (20 μg/mL)作用TGF-β1 (10ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24 h后,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析COE作用前后蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異,并對差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果：不同濃度(2.5,5, 10ng/mL)的TGF-β1誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞24h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生梭形改變;E-cadherin的表達(dá)下調(diào),N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)；當(dāng)TGF-β1濃度為10ng/mL時,變化效果最顯著(P0.001)。不同濃度(10,20,40,80,160, 320μg/mL)的COE作用SGC-7901細(xì)胞24 h后,細(xì)胞的生長呈現(xiàn)不同程度的抑制,并呈一定的濃度依賴性；當(dāng)COE濃度20時,對細(xì)胞的增殖無影響(P0.05)。不同濃度(5,10,20μg/mL)的COE作用TGF-β1 (10ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24h后,隨著COE濃度的增加,細(xì)胞逐漸恢復(fù)成卵石狀不典型上皮形態(tài),且E-cadherin表達(dá)逐漸上調(diào),N-cadherin和Vimentin表達(dá)逐漸下調(diào),細(xì)胞的侵襲和遷移能力也逐漸降低,提示COE可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞EMT的發(fā)生。蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗的結(jié)果表明,與對照組相比,在TGF-β1組表達(dá)上調(diào),且在COE組中表達(dá)下調(diào)的差異蛋白點(diǎn)共4個；通過質(zhì)譜分析鑒定為熱休克蛋白27 (heat shock protein 27, HSP27)、抗增殖蛋白(Prohibitin)、絲切蛋白(Cofilin-1)、膜聯(lián)蛋白A5(Annexin A5)。結(jié)論：COE可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌SGC-7901細(xì)胞EMT的發(fā)生,其作用機(jī)制可能是HSP27、Prohibitin、Cofilin-1、Annexin A5等靶點(diǎn)蛋白共同參與的結(jié)果。第二部分HSP27在南蛇藤提取物抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和調(diào)控NF-κB/Snail信號通路中的作用目的：以HSP27為研究切入點(diǎn),探討HSP27在COE抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞EMT發(fā)生中的作用,以及HSP27在COE對腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)誘導(dǎo)的核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)/Snail信號通路調(diào)節(jié)中的作用。方法：不同濃度(5,10,20 μg/mL)的COE作用于TGF-β1 (10 ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24 h后,Western blot和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測細(xì)胞中HSP27蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化,以探討COE對SGC-7901細(xì)胞HSP27基因表達(dá)的影響。COE(20μg/mL)和蛋白酶體抑制劑MG132 (1 μM)共同作用于TGF-β1誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24 h后,Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中HSP27蛋白表達(dá)的變化,以明確COE降解HSP27蛋白的可能途徑。構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-HSP27,將其轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞,篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞株SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27, Western blot技術(shù)探討HSP27是否具有調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞EMT發(fā)生的作用。COE (20μg/mL)作用于TGF-β1 (10 ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27細(xì)胞24 h后,Western blot和Transwell小室實(shí)驗分別檢測上述兩種細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、 Vimentin)表達(dá)的水平和細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化,明確HSP27在COE抑制胃癌EMT中的作用。不同濃度(5,10,20 μg/mL)的COE作用于TNF-α(10 ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24 h后,雙熒光素酶的報告基因檢測技術(shù)檢測COE對細(xì)胞NF-κB啟動子活性的影響。不同濃度(5,10,20μg/mL)的COE作用于SGC-7901細(xì)胞12h后或COE(20μg/mL)作用SGC-7901細(xì)胞1、3、6、12 h后,Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中NF-κB/Snail信號通路中關(guān)鍵蛋白(NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、Snail)表達(dá)的情況,從而明確COE對SGC-7901細(xì)胞中NF-κB/Snail信號通路的影響。COE (20 μg/mL)分別作用于TNF-α (10 ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27細(xì)胞,通過雙熒光素酶的報告基因檢測技術(shù)及Western blot技術(shù),進(jìn)一步明確HSP27在COE對TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB/Snail信號通路調(diào)節(jié)中的作用。結(jié)果：不同濃度(5,10,20μg/mL)的COE作用于TGF-β1 (10 ng/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24 h后,呈濃度依賴性的抑制HSP27蛋白的表達(dá)水平(P0.05),但對HSP27 mRNA表達(dá)水平無影響(P0.05)。當(dāng)加入MG132 (1 μM)后,能夠明顯減弱COE對HSP27蛋白的抑制作用(P0.01),表明COE所致的HSP27蛋白水平的降低,其機(jī)制可能與促進(jìn)HSP27的泛素化,加快其降解有關(guān)。成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-HSP27,轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后,篩選出逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞株SGC-7901-MIGR1-HSP27和SGC-7901-MIGR1和。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與SGC-7901細(xì)胞相比,SGC-7901-MIGR1細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表達(dá)無變化(P0.05); SGC-7901-MIGR1-HSP27細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P0.01), Vimentin和N-cadherin蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01)；且SGC-7901-MIGR1-HSP27細(xì)胞的變化效果與TGF-β1 (10 ng/mL)誘導(dǎo)后的結(jié)果基本相一致,提示HSP27具有促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞EMT發(fā)生的作用。COE (20μg/mL)作用于TGF-β1 (10μg/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901-MIGR1和SGC-7901-MIGR1-HSP27細(xì)胞24 h后,能夠明顯上調(diào)上述兩種細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)(P0.01),下調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)(P0.01),抑制兩種細(xì)胞的侵襲和遷移能力(P0.01)；且與作用于SGC-7901-MIGR1細(xì)胞相比,COE對SGC-7901-MIGR1-HSP27細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用和對細(xì)胞侵襲、遷移能力的抑制作用均明顯減弱(P0.01),提示HSP27的過表達(dá)能夠阻止COE對胃癌細(xì)胞EMT發(fā)生的抑制作用。不同濃度(5、10、 20μg/mL)的COE作用于TNF-α誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞24 h后,NF-κB熒光素酶活性與TNF-α組相比明顯下降(P0.05),表明COE有抑制NF-κB啟動子活性的作用。不同濃度(5,10,20μg/mL)的COE作用于SGC-7901細(xì)胞12 h后或COE (20μg/mL)作用SGC-7901細(xì)胞1、3、6、12 h后,細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB p65的表達(dá)均明顯降低(P0.05)；細(xì)胞漿內(nèi)的NF-κB p65、IκBα的表達(dá)均明顯增高(P0.05), p-IκBα、Snail的表達(dá)量均明顯下降(P0.05),且呈濃度和時間依賴性；提示COE可以通過抑制IκBα的磷酸化和降解,避免IκBα的磷酸化帶來的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的發(fā)生,發(fā)揮下調(diào)Snail表達(dá)的作用。COE (20μg/mL)作用于TNF-α (10 μg/mL)誘導(dǎo)的SGC-7901-MIGR1-HSP27和SGC-7901-MIGR1細(xì)胞后,COE能明顯抑制上述兩種細(xì)胞中NF-κB熒光素酶的活性(P0.01),能夠明顯上調(diào)兩種細(xì)胞中IκBα的表達(dá)(P0.01),降低p-IκBα, Snail的表達(dá)(P0.01),抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的發(fā)生；且與作用于SGC-7901-MIGR1細(xì)胞相比,COE對SGC-7901-MIGR1-HSP27細(xì)胞中NF-κB熒光素酶活性和NF-κB/Snail信號通路的抑制作用均明顯減弱(P0.01),提示HSP27的過表達(dá)能夠阻止COE對NF-κB/Snail信號通路的抑制作用。結(jié)論：COE主要通過調(diào)控HSP27來抑制胃癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,且HSP27在COE抑制細(xì)胞EMT和調(diào)控NF-κB/Snail信號通路中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。第三部分南蛇藤提取物抑制胃癌荷瘤裸鼠的生長和轉(zhuǎn)移目的：觀察COE對裸鼠胃癌皮下移植瘤生長的影響,以及COE對裸鼠胃癌腹腔轉(zhuǎn)移瘤腹膜種植轉(zhuǎn)移和肝肺轉(zhuǎn)移的影響：并在上述動物模型中探討HSP27及其下游NF-KB/Snail信號通路是否參與了COE對胃癌EMT的抑制作用。方法：將對數(shù)期的胃癌SGC-7901細(xì)胞分別注射在裸鼠皮下和腹腔,分別建立裸鼠胃癌的皮下移植瘤和腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型。隨機(jī)分為正常組、對照組(含1%DMSO的生理鹽水溶液),COE低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、局(40mg/kg)劑量組,希羅達(dá)(267mg/kg)組,各組裸鼠均灌胃給藥。治療期間每天觀察各組裸鼠的精神狀態(tài)、飲食和活動狀態(tài)等一般情況。對于皮下移植瘤模型,每隔2d稱量裸鼠體重,測算各組裸鼠的腫瘤體積,繪制動態(tài)變化的生長曲線；并在治療結(jié)束后,處死各組裸鼠,剝?nèi)∧[瘤后稱量瘤重,計算腫瘤抑制率。對于腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型,每隔2d稱量裸鼠的體重,觀察裸鼠腹部情況,并在治療結(jié)束后,處死各組裸鼠,觀察各組裸鼠的腹膜種植轉(zhuǎn)移和肝肺轉(zhuǎn)移的情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測上述模型的各組裸鼠腫瘤組織中EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、 Vimentin)、HSP27、NF-κB p65、Snail的表達(dá)水平。結(jié)果：成功建立裸鼠胃癌皮下移植瘤和腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型,并使用不同劑量的COE處理各組荷瘤裸鼠。對于皮下移植瘤模型,各組裸鼠的飲食、行為和精神狀態(tài)在治療過程中并無明顯異常,且COE各劑量組裸鼠體重與對照組相比也無顯著性差異(P0.05)。治療結(jié)束后處死裸鼠,發(fā)現(xiàn)COE各劑量組能明顯抑制移植瘤的體積和瘤重(P0.01),且呈劑量依賴效應(yīng)。對于腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型,COE各劑量組中裸鼠的活動及生長狀態(tài)在治療過程中均明顯好于對照組。治療結(jié)束后,發(fā)現(xiàn)各組裸鼠的大網(wǎng)膜、腸系膜上均有散在的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),但COE各劑量組中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)目較對照組相比明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。我們重點(diǎn)統(tǒng)計了各組裸鼠腹膜種植轉(zhuǎn)移和肝肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率,發(fā)現(xiàn)COE各劑量組能夠明顯抑制腹腔轉(zhuǎn)移瘤的腹膜種植轉(zhuǎn)移和肝肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生(P0.05),且呈劑量依賴效應(yīng)。免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果表明：COE可明顯上調(diào)上述兩種模型的移植瘤組織中E-cadherin的表達(dá)(P0.05),下調(diào)N-cadherin、Vimentin、HSP27、NF-κB p65、Snail蛋白的表達(dá)(P0.05),而且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論：COE對胃癌荷瘤裸鼠的生長和轉(zhuǎn)移均有明顯的抑制作用,其作用機(jī)制可能與COE調(diào)控HSP27及其下游NF-κB/Snail信號通路而抑制腫瘤EMT的發(fā)生有關(guān)。
【圖文】：

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本文編號：2566877