【摘要】：腫瘤的建立和進展需要有利于其生存的環(huán)境,即腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中除含有腫瘤和宿主細胞分泌的多種可溶性因子和細胞外基質(zhì)外,還包括內(nèi)皮細胞、周細胞、成纖維細胞和免疫細胞等多種非腫瘤細胞。通過這些分子和細胞的相互作用,腫瘤微環(huán)境不僅能提供腫瘤生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移所需要的組份(細胞和分子),而且能有效地保護腫瘤細胞免受宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。髓系來源的抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是腫瘤微環(huán)境中促進腫瘤生長和形成免疫抑制微環(huán)境的重要細胞群。MDSCs是一群異質(zhì)性的細胞群,由處于不同分化階段的髓系細胞組成。在正常生理條件下,來源于骨髓的未成熟髓系細胞會迅速分化為三種成熟的髓系細胞,即巨噬細胞、粒細胞和樹突狀細胞,這些細胞是機體固有免疫和適應性免疫所必需的。但在腫瘤、自身性免疫反應、慢性感染等病理性條件下,髓系細胞分化受阻,導致未成熟的髓系細胞累積,并獲得免疫抑制功能。在小鼠中,MDSCs共表達CD11b和Gr-1標志物。根據(jù)抗原表位和形態(tài)不同,MDSCs可以分為單核樣和粒細胞樣MDSCs。MDSCs通過多種途徑抑制機體固有免疫和適應性免疫,其作用主要通過表達高水平的精氨酸酶1 (Arginase-1, ARG1)和誘導性NO合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS),產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(Nitric oxide, NO),以及釋放IL-10、TGF-p等抑制性細胞因子。目前,有關MDSCs的研究大多局限于其表型分析和促腫瘤生長作用,對于調(diào)控其活化以及累積的細胞內(nèi)信號途徑知之甚少。CUL4B屬于CULLIN基因家族,該家族成員編碼的蛋白質(zhì)是CULLIN-RING泛素連接酶(CRL)復合物的支架蛋白。CRLs是目前已知的E3泛素連接酶中最大的一類,其主要作用是識別并泛素化特異性的底物,從而參與調(diào)節(jié)包括細胞周期、細胞信號轉(zhuǎn)導、基因轉(zhuǎn)錄、和生物體個體生長發(fā)育等重要生命活動。近期研究還發(fā)現(xiàn)CUL4B在多種實體瘤中高表達,通過轉(zhuǎn)錄抑制一組抑癌基因表達而發(fā)揮癌基因作用。作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,CRL4B通過單泛素化H2AK119,協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制復合物PRC2、SUV39H1/HP1/DNMT3A復合物等調(diào)控組蛋白甲基化和DNA甲基化。人類CUL4B基因突變導致X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征,我們實驗室前期發(fā)現(xiàn)的家系患者除表現(xiàn)出顯著的智力低下表型外,還伴有身材矮小、失語、短指、巨舌以及單核細胞增多的現(xiàn)象。到目前為止,已經(jīng)有超過20個X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征家系患者被報道攜帶CUL4B突變�；蚯贸∈笱芯勘砻�,全身性敲除小鼠Cul4b基因?qū)е屡咛ピ缙谒劳?我們的研究發(fā)現(xiàn)雜合子雌鼠由于胎盤血管發(fā)育異常而出現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩。這些研究提示CUL4B在多個系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用�；谏鲜鍪聦�,本研究將利用條件性敲除小鼠模型分析CUL4B在血細胞分化和血管新生中的作用。第一部分Cul4b條件性敲除小鼠的建立與表型分析我們的前期研究結(jié)果顯示Cul4b敲除雜合子小鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩是由于胎盤血管發(fā)育異常所致；CUL4B突變的X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征患者表現(xiàn)出單核細胞增多的表型。這些結(jié)果使我們有理由相信CUL4B在血管新生和血細胞分化中發(fā)揮重要作用。為驗證這一假設,本部分我們首先建立并分析了內(nèi)皮細胞和造血祖細胞特異性敲除Cul4b基因的Tek-Cre條件性敲除小鼠。1.建立Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-條件性敲除小鼠模型：Tek-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠CRE酶的表達受Tek基因啟動子和增強子調(diào)控,Tek基因在內(nèi)皮細胞和造血祖細胞中表達。為獲得組織特異性敲除小鼠,我們將實驗室前期構(gòu)建的Cul4bflox/flox基因打靶小鼠與Tek-Cre+/-轉(zhuǎn)基因鼠交配,獲得Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-條件性敲除小鼠(Cul4bCKO)；我們分別利用免疫組化、Western Blot和實時定量RT-PCR方法證實Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-敲除小鼠的內(nèi)皮細胞和造血細胞中CUL4B得到有效敲除。2. Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-小鼠的表型：我們對Cul4b CKO小鼠和野生對照小鼠的主要組織進行HE染色,結(jié)果顯示Cul4b CKO小鼠沒有明顯的組織學異常；外周血有核細胞進行計數(shù)分析未發(fā)現(xiàn)白細胞主要亞群在兩種基因型小鼠間的明顯差異,而流式檢測結(jié)果顯示Cul4b CKO小鼠外周血、脾臟以及骨髓中都有CD11b+Gr-1+細胞群的累積,未發(fā)現(xiàn)其它成熟的細胞亞群比例的明顯變化,分析這群細胞對T細胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)這群細胞獲得了免疫抑制能力。第二部分 宿主造血系統(tǒng)CUL4B缺失促進腫瘤生長并伴隨MDSCs累積與活化上部分結(jié)果顯示造血系統(tǒng)CUL4B缺失導致CD11b+Gr-1+細胞群累積,而且累積的這群細胞具有抑制T細胞增殖的能力,因為這群細胞(即MDSCs)在腫瘤誘導下迅速累積并促進腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移,為此,本部分利用移植瘤模型分析了CUL4B缺失對MDSCs的影響。1.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進移植瘤生長：我們向Cul4b CKO小鼠及其對照小鼠皮下接種B16/F0與EL4移植瘤,結(jié)果顯示CUL4B缺失導致腫瘤細胞在Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-小鼠體內(nèi)更為迅速地生長。2.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進MDSCs的累積：流式細胞術(shù)檢測兩組荷瘤小鼠外周血、脾臟、骨髓以及腫瘤組織中MDSCs的比例,結(jié)果顯示MDSCs田胞群在Cul4b CKO小鼠體內(nèi)的累積明顯多于野生對照小鼠,并且這種累積現(xiàn)象在MDSCs的兩個亞群中都存在；為了排除Cul4b CKO小鼠體內(nèi)MDSCs累積的增多是腫瘤生長更速度快帶來的效應,我們在荷瘤6天時進行上述組織的流式檢測,結(jié)果顯示在這個腫瘤生長沒有差異的時間點,MDSCs細胞群在兩種基因型小鼠中的累積已經(jīng)存在顯著差異,證實了CUL4B對MDSCs累積的負調(diào)控作用。3. CUL4B缺失的MDSCs介導了Cul4b CKO小鼠體內(nèi)腫瘤更快的生長：我們采用MDSC/EL4腫瘤細胞混合移植的模型以及骨髓移植模型檢測了CUL4B缺失導致的移植瘤生長速度加快是否是MDSCs介導的,結(jié)果顯示混合CUL4B缺失MDSCs的腫瘤細胞在野生型小鼠體內(nèi)生長更為迅速；移植了CUL4B缺失MDSCs的受體小鼠體內(nèi)腫瘤生長更快并伴隨受體小鼠自體MDSCs更快的累積。4.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進機體的免疫耐受：有報道稱MDSCs在抑制機體免疫反應的同時可以抑制機體的免疫排斥反應,促進機體產(chǎn)生免疫耐受。為了檢測Cul4b基因敲除是否改變機體的免疫耐受能力,我們利用BaBL/c小鼠來源的乳腺癌細胞系4T1對兩種基因型小鼠進行皮下接種,結(jié)果顯示CUL4B缺失的小鼠可以耐受4T1腫瘤細胞生長,而野生對照小鼠完全排斥了異源腫瘤的生長。5.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失增強MDSCs的免疫抑制能力：MDSCs的免疫抑制功能主要表現(xiàn)在對T細胞功能的抑制,我們對MDSCs免疫抑制能力的檢測結(jié)果顯示：在體外共培養(yǎng)實驗中,CUL4B缺失的MDSCs兩個亞群對CD4+或CD8+T細胞的增殖都有更明顯的抑制作用。在荷瘤小鼠體內(nèi),Cul4b CKO、鼠腫瘤組織內(nèi)浸潤的CD4+和CD8+T細胞比例都明顯低于野生型,與此一致的是,CUL4B缺失后荷瘤小鼠外周血以及脾臟中T細胞兩個亞群的比例也都顯著降低；同時,CUL4B缺失后MDSCs胞內(nèi)發(fā)揮抑制作用的效應分子的表達水平普遍有所升高,對應的效應產(chǎn)物ROS以及NO的釋放也明顯增多,證實CUL4B對MDSCs活化的負調(diào)控作用。6. CUL4B缺失導致MDSCs分化異常：為了探究CUL4B缺失導致MDSCs累積加快的原因,我們對MDSCs的增殖和凋亡情況進行了檢測,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)MDSCs的增殖與凋亡在兩種基因型間存在差異；接下來,我們檢測了CUL4B缺失后造血祖細胞向MDSCs分化的能力,流式檢測結(jié)果顯示CUL4B缺失的造血祖細胞分化為MDSCs的比例明顯增名：腫瘤誘導的MDSCs累積常常歸因干其成熟分化的受阻,所以我們進一步對分離純化的MDSCs進行體外誘導培養(yǎng),流式檢測結(jié)果顯示CUL4B缺失的MDSCs向成熟的巨噬細胞以及樹突細胞分化的能力明顯減弱。綜合看來,CUL4B的缺失通過促進造血祖細胞向MDSCs的分化以及阻礙MDSCs的成熟分化兩方面機制造成了MDSCs的累積。第三部分CUL4B通過正向調(diào)控AKT/β-catenin信號通路抑制MDSCs的累積與活化以上結(jié)果提示我們CUL4B既可以調(diào)控MDSCs的累積也可以影響其活性,那么這中間的機制又是怎樣的呢,我們進行了以下分析：1. CUL4B通過調(diào)控GSK3P介導的β-catenin降解抑制MDSCs的累積：有報道顯示β-catenin在MDSCs的累積與免疫抑制功能中發(fā)揮重要作用。為探究CUL4B調(diào)控MDSCs的累積和活化過程是否依賴β-catenin,我們對β-catenin的蛋白水平進行了檢測,結(jié)果顯示CUL4B缺失后MDSCs胞內(nèi)伴隨著GSK3β活性升高p-catenin的降解增多,從而導致β-catenin蛋白水平下降,而且這一降解增多的現(xiàn)象可以被GSK3β的抑制劑拯救；利用GSK3β的抑制劑分別對分離純化后的Lin-造血祖細胞和MDSCs進行體外誘導處理,流式檢測結(jié)果顯示CUL4B缺失所導致的造血祖細胞向MDSCs分化增多以及MDSCs進一步成熟分化受阻的現(xiàn)象都有所改善；利用β-catenin持續(xù)表達的慢病毒分別感染分離純化后的Lin-造血祖細胞和MDSCs后進行誘導分化實驗,也得到了相同的結(jié)果；在體內(nèi),給小鼠腹腔注射LiCl后,Cul4b CKO小鼠外周血中CD11b+ Gr-1+細胞群的累積明顯緩解,同時再對小鼠進行荷瘤實驗,CUL4B缺失所引起的腫瘤生長加快的現(xiàn)象也得到明顯拯救。因此,我們得出結(jié)論CUL4B通過上調(diào)β-catenin的表達負向調(diào)控MDSCs的累積與活化過程。2. CRL4B協(xié)同PRC2和HDACs轉(zhuǎn)錄抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表達從而促進AKT激酶的活性：為了進一步探究CUL4B調(diào)控GSK3β活性的機制,我們對野生以及敲除小鼠來源的MDSCs中β-GSK3β (Ser9)的激酶AKT的活性進行了檢測,結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)代表AKT活性的Thr308和Ser473兩個位點的磷酸化水平在CUL4B缺失之后都有不同程度地降低,進一步研究發(fā)現(xiàn)這兩個位點磷酸化水平的降低是它們對應的磷酸酶PP2A以及PHLPP1/2表達水平的升高引起的。通過ChIP實驗,我們證實CRL4B、PRC2和HDACs復合物的主要成分共同結(jié)合于PP2A以及PHLPP1/2對應基因的啟動子區(qū)域,q-ChIP結(jié)果顯示在CUL4B低表達的RAW264.7細胞中H2AK119的單泛素化水平明顯降低,PRC2的主要組分EZH2和HDACs在這幾個磷酸酶基因啟動子上的結(jié)合也明顯減少,同時伴有它們的底物H3K27三甲基化水平的降低以及組蛋白的乙�；降拿黠@升高,說明CUL4B對這些磷酸酶基因具有明顯的轉(zhuǎn)錄抑制作用。3. MDSCs的累積和活化與CUL4B/AKT/β-catenin信號通路呈負相關性：上述實驗顯示CUL4B缺失后引起的MDSCs中AKT/β-catennin信號通路的下調(diào)并且導致MDSCs的累積與活化,那么這種負調(diào)控關系在野生型MDSCs中是否也存在呢?我們分別在未免疫以及荷瘤小鼠來源的MDSCs中檢測CUL4B、PHLPP1/2、 PP2A、AKT、GSK3β以及P-catenin的表達情況,結(jié)果顯示在活化的MDSCs中,這些分子的表達水平與CUL4B缺失所導致的信號途徑的改變結(jié)果一致,同時伴隨著CUL4B表達的下調(diào)。與此相一致,癌癥患者MDSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信號也呈現(xiàn)一個顯著低于健康對照的狀態(tài),表明伴隨著腫瘤進程的發(fā)展,CUL4B/AKT/β-catenin信號通路在MDSCs中表達普遍下調(diào)。綜上,我們的研究發(fā)現(xiàn)：CUL4B可以限制免疫抑制腫瘤微環(huán)境的重要組分MDSCs的累積與活化,因而CUL4B的缺失促進了Cul4b CKO小鼠體內(nèi)移植瘤生長速度的加快以及其機體免疫耐受能力的增強；機制上,CUL4B通過協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制復合物PRC2和HDACs抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表達,進而促進AKT激酶的活性,下調(diào)GSK3β介導的β-catenin蛋白降解,從而負向調(diào)控MDSCs的異常累積；此外,相對比其它造血細胞,健康個體的MDSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信號途徑的表達下調(diào),而這下調(diào)一現(xiàn)象在荷瘤小鼠和腫瘤患者中更為顯著。因此,我們得出結(jié)論,雖然CUL4B在腫瘤細胞中發(fā)揮原癌基因的作用,但是在免疫抑制腫瘤微環(huán)境的形成中它卻發(fā)揮負調(diào)控因子的作用,證實CUL4B在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的雙面性。
【圖文】：

圖１小鼠親代交配策略逡逑

４．小鼠基因型鑒定逡逑４．１主要試劑逡逑１）邐ｌ0ｘ蛋白酶Ｋ消化緩沖溶液：逡逑成分邐濃度或體積比逡逑Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ邋（ｐＨ８．３）邐１００邋ｍＭ逡逑ＫＣｌ邐５００邋ｍＭ逡逑Ｔｗｅｅｎ－２０邐１％逡逑２）蛋白酶Ｋ溶液；逡逑成分邐質(zhì)量或體積逡逑蛋白酶Ｋ粉末邐１００邋ｍｇ逡逑滅菌Ｈ蒸水邐１０邋ｍｌ逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

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本文編號：2566253