【摘要】：[目的]：據(jù)統(tǒng)計,結(jié)直腸癌每年有100多萬例新發(fā)病例¨。新輔助放化療在直腸癌患者治療中起重要作用。隨著新輔助放化療運用的日趨廣泛,放化療抵抗的問題也日趨凸顯。研究顯示,基因表達異�？赡軐�(dǎo)致以5-Fu為基礎(chǔ)的同期放化療抵抗。本項目通過構(gòu)建直腸癌細(xì)胞體外同期放化療模型,誘導(dǎo)結(jié)直腸癌放化療抵抗細(xì)胞株,并運用全基因組表達譜芯片全面對比野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞和所誘導(dǎo)的同期放化療抵抗細(xì)胞株的基因差異,篩選結(jié)直腸癌細(xì)胞同期放化療抵抗的關(guān)鍵基因,以全面了解結(jié)直腸癌同期放化療抵抗機制。本項目將為進一步探索合理的干預(yù)措施以逆轉(zhuǎn)直腸癌放化療抵抗打下基礎(chǔ),并為臨床提供放化療療效提供理論依據(jù)。[方法]：1.采用10μmol/15-Fu及4Gy 6MV X-ray對人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116進行體外同期放化療,建立體外同期放化療抵抗人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株(chemoradioresistant cell, CRR cell);2. Clongenic Survival Assay法檢測同期放化療后HCT116細(xì)胞株的同期放化療抵抗性；3.全基因組表達譜芯片檢測同期放化療抵抗HCT116與其母細(xì)胞mRNA表達水平的差異；4.差異性表達mRNAs進行GO (gene ontology)分類,探索其生物學(xué)功能；5. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路分析與差異性表達基因相關(guān)的信號通路；6.隨機選擇6個差異性表達基因進行qRT-PCR驗證其mnRNA表達水平；7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析采用SPSS17.0軟件包進行,數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間資料應(yīng)用單因素方差分析(ONE WAY ANOVA)和t檢驗。[結(jié)果1：1.經(jīng)過10次體外同期放化療后,已建立同期放化療后HCT116殘癌細(xì)胞株；2. Clongenic Survival Assay法證實同期放化療后HCT116殘癌細(xì)胞株具有同期放化療抵抗性,為同期放化療抵抗細(xì)胞株；3.全基因組表達譜芯片共篩選了21811個mRNAs,以fold change 2為差異性表達基因篩選標(biāo)準(zhǔn),其中11.0%(2397/21811) mRNAs在HCT116 CRR細(xì)胞和HCT116母細(xì)胞中表達有差異；4.按GO生物學(xué)過程(Biological process),細(xì)胞構(gòu)成(Cellular component),分子功能(Molecular function)對差異性表達基因進行分類,發(fā)現(xiàn)差異性表達基因具有多種生物學(xué)功能；5. KEGG信號通路分析與差異性表達基因相關(guān)的信號通路,有57條信號通路(38條上調(diào),19條下調(diào))與差異性表達基因相關(guān)；6. qRT-PCR驗證中,隨機選擇的6個差異性表達基因中,除HOXB7外,其余5個基因的mRNAs上調(diào)、下調(diào)趨勢與基因芯片結(jié)果相同。[結(jié)論]：1.本實驗證實體外應(yīng)用模擬臨床結(jié)直腸癌治療的大劑量沖擊法可以增加人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的放化療抵抗性。成功建立放化療抵抗人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116,為結(jié)直腸癌放化療抵抗性的研究進一步奠定了基礎(chǔ)。2.結(jié)直腸癌放化療抵抗相關(guān)mRNA差異表達譜的建立,綜合信息學(xué)分析提供了數(shù)個可能的富集生物過程和富集通路,為后續(xù)的研究提供了研究的方向和依據(jù)。3.qRT-PCR檢測部分基因表達情況,與基因芯片結(jié)果大部分一致,提示基因芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【圖文】：

２．邋Ｃｏｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ對放化療后殘癌細(xì)胞株的放化療抵抗性鑒定結(jié)果逡逑Ｇｏｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ結(jié)果槰示ＨＣＴ１１６野生型細(xì)胞株克枦形成數(shù)明．思少逡逑于ＨＣＴ］１６ＣＲ民細(xì)胞（圖２），多視單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線（圖３），實驗逡逑}DＤｑ、Ｄｏ、ＳＦ２明雖低于照射組（表１）。逡逑Ｒａｄｉａｔｉｏｎ邋Ｄｏｓｅ邋（Ｇｙ）邋０邐２邐４邐?邐８邐１０逡逑廬冷．Ｖ邋：．邐．逡逑ＣＲＲＨＣＴ＂ｅＣｅ＂之：學(xué)女）‘？車．戶‘邐ｙ．逡逑若；？邋；邋＇邋？如＇．‘．，－逡逑．＊＊？＞．＊，逡逑Ｐａｒｅｎｔａｌ邋ＨＣＴ１１６邋Ｃｅｌｌ邋ｆ．逡逑罔２；邋Ｃｏｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ法鑒定細(xì)胞放化療抵抗性逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｒｅｓｉ邋巧邋ａｎｃｅ邋ｏｆ邋ＨＣＴ１１６邋Ｃ邋民民邋ｃｅＵ邋ｂｙ逡逑Ｃｌｏｎｇｅｎｉｃ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｓｓａｙ逡逑１邋廣＂？Ｉ邐？邋ＣＲＲ邋ＨＣＴ１１＃rP茫澹歟歟]3?0邋Ｐａ巧ｎｔａｌ邋ＨＣＴ１１６邋Ｃｅｌｌ逡逑置邐＊逡逑0＞邋．０１邋Ｉ邐＊逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑＞邐＊逡逑Ｉ邋．００１逡逑（／）逡逑．０００１邐邐？邐■邐邐邐邐邐ｉ逡逑０邐２邐４邐６邐８邐１０逡逑Ｄｏｓｅ邋（Ｇｙ）逡逑圖３：單擊多魄模型擬合細(xì)胞存活曲線逡逑Ｆｉｇ．３邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｃｕｒｖｅ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｂｙ邋化ｅ邋ｍｕｌｔｉ－ｔａｒｇｅｔ，邋ｓｉｎTB］ｅ－ｈｉｔ邋ｍｏｄｅｌ逡逑＊各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)比

ｌｌ邐０．５８８９邐２．３０１５邐１．１３１９檢測結(jié)果逡逑６巧細(xì)胞株，２號標(biāo)本為ＨＣＴ１１６ＣＲＲ細(xì)Ａ純度，，若ＯＤ值Ａ２６０／Ａ２８０比值接近１．８，提示純度達到實驗的要求（表巧。２８ｓ、１８ｓ清晰可見，比例約為２倍說Ａ合格，符合芯片檢測的要求，每管取７表２．艮ＮＡ紫外檢測結(jié)果逡逑ａｂ．２邋ＲＮＡ邋ｃｈｅｃｋｅｄ邋ｂｙ邋ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏ化ｍｅ化ｒ逡逑ＨＣＴ１１６母細(xì)胞邐ＨＣＴ１］６邐１．９９邐邐２．３６邐
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：2565436