【摘要】：非編碼RNA(Non-coding RNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學(xué)作用。作為一類新的非編碼RNA,環(huán)狀RNA(circular RNAs,circRNAs)近來被大量發(fā)現(xiàn)和鑒定并報道其與發(fā)育、細胞功能、某些病理生理反應(yīng)有關(guān),其作用方式通常是作為microRNAs分子海綿、靶向microRNAs分子,從而調(diào)節(jié)基因表達。目前,circRNAs的調(diào)節(jié)機制及其在腫瘤中的作用成為一個新興熱點研究領(lǐng)域。肝癌是嚴重危害我國人民健康的惡性腫瘤,深入研究肝癌的發(fā)展發(fā)展分子機制將有利于研發(fā)肝癌的新型治療方法。有關(guān)非編碼RNA包括microRNAs和長非編碼RNA(long non-coding RNAs,lnc-RNAs)在肝癌發(fā)生發(fā)展機制與治療意義方面已有較多報道,然而,關(guān)于circRNAs在肝癌中的表達譜分析及其作用和相關(guān)具體機制尚不清晰。在本研究中,我們分析了人肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)組織中的circRNAs 表達譜,鑒定出 circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_1 04135)是一種在肝癌患者的腫瘤組織中表達顯著下調(diào)的circRNA。通過組織芯片分析,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中低表達circMTO1的肝癌患者生存期顯著縮短,提示circMTO1作為一種預(yù)測肝癌患者預(yù)后的標志物和具有抑制肝癌生長作用的可能性�？紤]到circRNA通常是靶向microRNAs分子并作為microRNAs分子海綿而參與調(diào)控目的基因的表達,為此,我們結(jié)合軟件預(yù)測circMTO1可能作用的microRNAs,通過生物素標記的circMTO1探針在肝癌細胞系中進行RNA沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)miR-9是circMTO1相關(guān)的microRNA,并通過FISH證明circMTO1與miR-9在肝癌組織細胞漿中共定位。已有報道m(xù)iR-9在肝癌中高表達并促進HCC發(fā)展。我們進一步建立了肝癌中circMTO1敲減和高表達技術(shù)體系,發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中敲減circMTO1后可下調(diào)miR-9的靶標p21而促進肝癌細胞增殖和侵襲。在人HCC裸鼠模型腫瘤組織內(nèi)注射膽固醇結(jié)合的circMTO1 siRNA,可顯著抑制腫瘤組織中p21的表達、增加MMP2和PCNA的表達,促進HCC腫瘤生長�？梢�,circMTO1通過作為致癌性miR-9的分子海綿作用,促進了 miR-9的靶標抗癌基因p21表達,從而抑制肝癌發(fā)生發(fā)展�？傊�,人肝癌組織中低表達circMTO1可作為一種潛在的提示肝癌侵襲生長、患者不良預(yù)后的標志,circMTO1的抗腫瘤作用具有一定的臨床轉(zhuǎn)化意義。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA存在多種修飾形式,其中,N6-甲基腺苷化修飾(N6-methyladenosine,m6A)最為常見。RNA m6A修飾對于mRNA的剪接、運輸、翻譯和降解具有重要影響,參與絕大多數(shù)生理病理過程以及疾病發(fā)生發(fā)展。鑒于肝癌是嚴重危害我國人民健康的惡性腫瘤,而其RNAm6A修飾譜尚未見報道,因此,本課題建立了肝癌RNAm6A修飾研究平臺技術(shù)體系,應(yīng)用MeRIP-Seq技術(shù),獲得了人肝癌組織的RNAm6A修飾譜,同時通過Cas9技術(shù)體系,構(gòu)建和篩選了RNA甲基酶、去甲基酶、相關(guān)結(jié)合蛋白包括METTL3、YTDHF1、YTDHF2、ALKBH5、YTHDC1、WTAP、FTO、METTL14等基因敲除的人肝細胞癌細胞株,為進一步篩選靶標mRNA進行后續(xù)功能研究,探討m6A修飾變化與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及肝癌干擾素治療反應(yīng)性研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

浙江大學(xué)博±學(xué)位論文邐第一卻分實驗結(jié)呆逡逑析，結(jié)果顯示，與對照組相比，ｃｉｒｃＭＴＯｌ與ｍｉＲ－９在肝癌細胞質(zhì)中共定位，并且，逡逑在腫瘤姐織中，，ｃｉｒｃＭＴＯｌ與ｍｉＲ－９在肝癌細胞質(zhì)中的共定位比其在癌旁非腫瘤組織逡逑中的共定位減少（Ｆｉｇ．邋３Ｄ），這些結(jié)果提示，ｃｉｒｃＭＴＯｌ可能與ｍｉＲ－９在ＨＣＣ細胞結(jié)合，逡逑其結(jié)合可能發(fā)生在細胞質(zhì)中。逡逑

圖５邋ｄｒｃＭＴＯｌ悇過下調(diào)ｐ２１抑制ＨＣＣ細胞增殖和侵襲逡逑Ｆｉｇ．邋５．邋ｃｉｒｃＭＴＯｌ邋ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ邋ＨＣＣ邋ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｉｎｖａｓｉｏｎ邋ｂｙ邋ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ邋ｐ２１逡逑３５逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2562452