【摘要】：第一部分 FOXO3a在血清素促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和庵苎逅?5-羥色胺)在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生及促增殖過(guò)程中起到重要作用,然而血清素是如何發(fā)揮其促進(jìn)增殖作用的機(jī)制尚未清楚。FOXO3a是一個(gè)參與多種細(xì)胞關(guān)鍵信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄因子,在本研究中,我們將探尋FOXO3a是否在血清素介導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖的通路中發(fā)揮作用及其機(jī)制。 材料與方法：選取3種肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系(HuH-7、HepG2和Hep3B),利用細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)、細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Edu)及流式細(xì)胞周期檢測(cè)分別檢測(cè)血清素在有血清及無(wú)血清培養(yǎng)條件下對(duì)3種細(xì)胞系的細(xì)胞活力及增殖情況的影響,并且同時(shí)測(cè)量不同條件下細(xì)胞內(nèi)FOXO3a的mRNA、蛋白的磷酸化表達(dá)、細(xì)胞定位及FOXO3a上游調(diào)控因子AKT的磷酸化表達(dá)。利用RNAi干擾技術(shù)和細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別抑制和上調(diào)3種肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系中FOXO3a的表達(dá),觀察此時(shí)血清素在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞活力、增殖及細(xì)胞內(nèi)FOXO3a的mRNA及蛋白表達(dá)變化。檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下血清素2B受體的表達(dá),并且利用其特異性抑制劑觀察對(duì)血清素促增殖作用的影響及肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞內(nèi)FOXO3a的表達(dá)變化。結(jié)果：3種細(xì)胞系在無(wú)血清的培養(yǎng)條件下其細(xì)胞增殖受到嚴(yán)重抑制,血清素在無(wú)血清的培養(yǎng)條件下可以逆轉(zhuǎn)HuH-7細(xì)胞的增殖抑制,但在加入血清的培養(yǎng)體系中不能起到促使HuH-7細(xì)胞增殖的效果；血清素不能逆轉(zhuǎn)血清剝離環(huán)境中HepG2和Hep3B細(xì)胞的增殖抑制。血清剝離顯著下調(diào)了3種細(xì)胞FOXO3a的表達(dá),加入血清素可以顯著上調(diào)HuH-7細(xì)胞FOXO3a的表達(dá)但對(duì)HepG2和Hep3B細(xì)胞FOXO3a的表達(dá)則無(wú)影響。血清素上調(diào)了血清剝離環(huán)境中HuH-7細(xì)胞的FOXO3a及其上游激酶AKT的磷酸化水平,但對(duì)FOXO3a的核定位卻無(wú)影響；血清素不能改變血清剝離環(huán)境中HepG2和Hep3B細(xì)胞的FOXO3a的磷酸化表達(dá)。非磷酸化FOXO3a的質(zhì)�？梢燥@著上調(diào)FOXO3a的表達(dá)并且促使血清剝離環(huán)境中3種細(xì)胞的增殖；而干擾FOXO3a的表達(dá)促進(jìn)了血清剝離環(huán)境對(duì)3種細(xì)胞的增殖抑制作用。相較于HepG2和Hep3B細(xì)胞,血清素2B受體在HuH-7細(xì)胞中高表達(dá),其特異性抑制劑干擾了血清素誘導(dǎo)的HuH-7細(xì)胞FOXO3a的上調(diào)并逆轉(zhuǎn)了其促增殖作用。 結(jié)論：本研究結(jié)果表明,在血清剝離環(huán)境中FOXO3a是肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的促增殖因子,血清素通過(guò)上調(diào)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的FOXO3a起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用并且血清素的增殖作用是血清素2B受體介導(dǎo)的。以肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中血清素-血清素2B受體-FOXO3a通路為靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)藥物可以為肝細(xì)胞肝癌的治療提供新的思路。 第二部分 FOXO3a在多柔比星誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模焊渭?xì)胞肝癌治療中經(jīng)常發(fā)生的肝細(xì)胞肝癌化療耐藥是導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌死亡率一直居高不下的重要原因。多柔比星是肝細(xì)胞肝癌化療中最為常用的藥物之一,而肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞常發(fā)生的上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是造成肝細(xì)胞肝癌對(duì)多柔比星耐藥的主要原因。鹽霉素是一種離子載體類(lèi)抗生素,其可以選擇性殺傷腫瘤干細(xì)胞。在本研究中,我們將探索鹽霉素是否與多柔比星可以發(fā)揮協(xié)同殺傷肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的作用及其中的內(nèi)在機(jī)制。 材料與方法：選取4種肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系(HuH-7、HepG2、SNU-449和SNU-387),利用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒與蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞在多柔比星單用或多柔比星聯(lián)和鹽霉素處理后的細(xì)胞活力和上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的相關(guān)蛋白指標(biāo)。利用蛋白免疫印跡技術(shù)及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞在多柔比星單用或多柔比星聯(lián)和鹽霉素處理后FOXO3a的表達(dá)水平、磷酸化水平及亞細(xì)胞定位。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者FOXO3a siRNA技術(shù)上調(diào)或者抑制FOXO3a的表達(dá),觀察肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞對(duì)多柔比星單用或多柔比星聯(lián)和鹽霉素處理的細(xì)胞活性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白指標(biāo)的表達(dá)變化。利用細(xì)胞免疫共沉淀技術(shù)觀察FOX03a與對(duì)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要因子β-catenin的相互結(jié)合情況及β-catenin/TCF靶基因(ZEB1、c-Myc和CyclinD1)的表達(dá)情況。最后,我們建立了裸鼠肝細(xì)胞肝癌異種移植瘤模型,在體內(nèi)檢測(cè)了鹽霉素是否與多柔比星發(fā)揮協(xié)同殺傷肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的作用。 結(jié)果：多柔比星顯著上調(diào)了肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞間質(zhì)表型標(biāo)志蛋白vimentin的表達(dá),下調(diào)了上皮表型標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)；鹽霉素可以逆轉(zhuǎn)多柔比星作用后肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞所發(fā)生的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)變化并且顯著增強(qiáng)了多柔比星的細(xì)胞毒性。此外,多柔比星導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞FOXO3a磷酸化水平的上調(diào),導(dǎo)致FOXO3a的細(xì)胞質(zhì)定植；鹽霉素可以逆轉(zhuǎn)多柔比星誘導(dǎo)的FOXO3a磷酸化并且使FOXO3a在細(xì)胞核內(nèi)積聚。抑制FOXO3a的表達(dá)使鹽霉素不能逆轉(zhuǎn)多柔比星引起的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并且破壞了鹽霉素對(duì)多柔比星的促殺傷作用,而過(guò)表達(dá)活化的FOXO3a抑制了多柔比星誘導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并且顯著的增強(qiáng)了其對(duì)多柔比星的感敏性。β-catenin/TCF的相互作用及其調(diào)控的下游因子的表達(dá)是多柔比星誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子,β-catenin/TCF結(jié)合特異性抑制劑PKF118-310抑制了多柔比星誘導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并且顯著的增強(qiáng)了其對(duì)多柔比星的感敏性。過(guò)表達(dá)活化的FOX03a或鹽霉素處理促使FOXO3a/β-catenin的相互結(jié)合,使β-catenin/TCF失偶聯(lián),并且抑制了TCF4依賴性下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,干擾了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。 結(jié)論：本研究表明多柔比星誘導(dǎo)的FOXO3a出核失活對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化十分必要,鹽霉素可以通過(guò)抑制多柔比星誘導(dǎo)的FOXO3a出核使FOXO3a在核內(nèi)聚集,并且競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合β-catenin,抑制TCF4依賴性下游關(guān)鍵靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而抑制肝細(xì)胞肝癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)其對(duì)多柔比星的感敏性。
【圖文】：

只11只-7細(xì)胞在50^1"或者100^;：\4血清素的作用下，表現(xiàn)出與正常血清培養(yǎng)條件下相同的增殖趨勢(shì)（圖 1A; SFM vs. SFM +5-HT (SOfiM),*** P < 0.001, two-wayANOVA)； HepG2和Hep3B則對(duì)血清素不敏感，，細(xì)胞增殖受到抑制（圖IB、C)。

博士學(xué)位論文 文F0X03a在血清素促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞糟殖中的作用血清素對(duì)HuH-7細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下增殖作用的影了進(jìn)一步理解血清素對(duì)HuH-7細(xì)胞的促增殖作用的影響，我們同時(shí)0%FBS的培養(yǎng)集中，血清素是否對(duì)HuH-7細(xì)胞有促增殖作用。發(fā)現(xiàn)下血清素并沒(méi)有導(dǎo)致HuH-7細(xì)胞的增殖能力變強(qiáng)（圖2; P>0.05, A)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Ana R.Gomes;Fung Zhao;Eric W.F.Lam;;Role and regulation of the forkhead transcription factors FOXO3a and FOXM1 in carcinogenesis and drug resistance[J];Chinese Journal of Cancer;2013年07期

2 高姍;楊萬(wàn)水;張薇;高靜;項(xiàng)永兵;;原發(fā)性肝癌全人群生存率的分析和比較[J];腫瘤;2010年12期

3 Hong Sun;Man-Sheng Zhu;Wen-Rui Wu;Xiang-De Shi;Lei-Bo Xu;;Role of anti-angiogenesis therapy in the management of hepatocellular carcinoma: The jury is still out[J];World Journal of Hepatology;2014年12期

本文編號(hào)：2562431