【摘要】：背景：肺癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。由于肺癌病人早期癥狀不典型,同時缺乏敏感的篩查指標(biāo)及有效的確診方法,大多數(shù)患者就診時已處于中晚期,因此失去手術(shù)治療的機(jī)會；放療化療毒副作用較大,不能高度特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞；此外由于肺癌容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,即使在腫瘤完全切除的情況下肺癌患者大多也會死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。肺癌的預(yù)后難以評估,同一分期、同一組織學(xué)類型、采用同一治療方案的肺癌患者,其治療效果和遠(yuǎn)期生存情況會有明顯不同。當(dāng)前國際廣泛采用的肺癌TNM分期存在諸多不足,尤其是對于開展肺癌患者個體化的治療及預(yù)后評估等發(fā)揮的作用極為有限。近年來,有關(guān)microRNA (miRNA)與肺癌特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生發(fā)展、診斷治療的關(guān)系備受關(guān)注。微小RNA是由約22個核苷酸組成的非編碼、小分子單鏈RNA；具有較高的保守性,幾乎存在于所有的真核細(xì)胞。深入研究miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,將為肺癌的診治提供新的方案和新的靶點。目的：在非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本和癌旁標(biāo)本組織中用Real Time PCR方法檢測miR-204-5p的表達(dá)情況。體外實驗中根據(jù)一系列實驗方法鑒定miR-204-5p在肺癌A549和HCC827細(xì)胞株中的生物學(xué)功能。通過信息學(xué)預(yù)測軟件對miR-204-5p作用靶點進(jìn)行預(yù)測,并用生物學(xué)功能實驗加以驗證。方法：1.在30對配對的肺癌和癌旁組織標(biāo)本中檢測miR-204-5p的相對表達(dá)量,對肺癌組織及對照的癌旁組織中miR-204-5p的表達(dá)差異進(jìn)行統(tǒng)計,并分析不同病理分期的肺癌中miR-204-5p的表達(dá)情況；2.在BEAS-2B和肺癌細(xì)胞A549. HCC827細(xì)胞檢測miR-204-5p的相對表達(dá)量。對肺癌A549和HCC827細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-204-5p mimic使細(xì)胞過表達(dá)miR-204-5p,然后進(jìn)行相關(guān)功能學(xué)的實驗檢測。通過CCK-8、平板克隆形成、流式細(xì)胞周期檢測和流式細(xì)胞凋亡檢測、劃痕愈合實驗和Transwell小室法等方法分析上調(diào)miR-204-5p表達(dá)后對細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移侵襲等能力的影響；3. miR-204-5p的靶基因通過在線軟件進(jìn)行預(yù)測,然后通過Real Time PCR, Western Blot等方法驗證靶基因mRNA及蛋白表達(dá)量是否發(fā)生變化。并用熒光素酶雙報告系統(tǒng)對miR-204-5p的靶序列進(jìn)行鑒定；應(yīng)用拯救實驗(Rescue實驗)進(jìn)一步驗證miR-204-5p作用的靶基因。結(jié)果：1.收集的30對肺癌和癌旁組織標(biāo)本中,有27例miR-204-5p相對低表達(dá),比例占90%。癌組織中miR-204-5p表達(dá)量平均約癌旁組織的1/2。高分期肺癌與低分期肺癌在miR-204-5p的相對表達(dá)量的平均值有差異,但未能有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性意義。2與正常肺組織上皮細(xì)胞株BEAS-2B相比,肺癌A549和HCC827細(xì)胞株中miR-204-5p呈現(xiàn)為低表達(dá)的狀態(tài)。體外轉(zhuǎn)染miR-204-5p至肺癌A549和HCC827細(xì)胞株使miR-204-5p過表達(dá)：50nM濃度可以抑制細(xì)胞增殖活力；體外平板克隆形成實驗表現(xiàn)為抑制細(xì)胞克隆形成；細(xì)胞周期實驗出現(xiàn)G1期阻滯。劃痕愈合實驗和Transwell小室等實驗顯示miR-204-5p過表達(dá)未能顯著減弱A549和HCC827細(xì)胞的遷移和細(xì)胞侵襲能力,對細(xì)胞凋亡無明顯影響。3.通過在線軟件的預(yù)測,分析CCND1可能是miR-204-5p靶基因,通過Real Time PCR和Western Blot實驗檢測發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)miR-204-5p后靶基因CCND1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平都顯著下調(diào)。熒光素酶雙報告系統(tǒng)結(jié)果證實CCND1是miR-204-5p的直接作用靶點,miR-204-5p調(diào)控的作用序列存在于其3'-UTR中。結(jié)論：肺癌組織中miR-204-5p是一個抑癌基因,miR-204-5p可以通過靶基因CCND1抑制A549細(xì)胞和HCC827細(xì)胞的增殖能力。
【圖文】：

圖１．３．２邋３０例肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ表達(dá)量（Ｗ內(nèi)參Ｕ６參比）。肺癌組織中逡逑ｍｉＲ－２０４－５ｐ相對表達(dá)量要顯著化于癌旁正常組織（＊：ｔ檢驗，Ｐ＜０．０５）逡逑．瓜－－

令於邐�！╁义蠄D１．３．２邋３０例肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ表達(dá)量（Ｗ內(nèi)參Ｕ６參比）。肺癌組織中逡逑ｍｉＲ－２０４－５ｐ相對表達(dá)量要顯著化于癌旁正常組織（＊：ｔ檢驗，Ｐ＜０．０５）逡逑１．３．３不同分期的肺癌中ｍ瓜－２０４－５ｐ的表達(dá)情況逡逑在３０例肺癌標(biāo)本中，根據(jù)病理Ｔ和Ｎ分期將標(biāo)本進(jìn)行分組，，其中Ｔ１期肺癌逡逑１７例，Ｔ２期及Ｗ上肺癌１３例；其中ＮＯ期肺癌８例，Ｎ１期及Ｗ上肺癌２２例。不逡逑同分期的肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ的相對表達(dá)量如表１．３．３所示，經(jīng)Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎ巧檢驗逡逑未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異（表１．３．３、圖１．３．３和圖１．３．４）。逡逑表１．３．３不同病理分期的肺癌中ｍｉＲ－２０４－５ｐ的相對表達(dá)量逡逑臨床指標(biāo)分期（Ｔ）邐ｍｉＲ－２０４－５ｐ相對表達(dá)量邐Ｐｉｔ＊逡逑Ｔ分期邐０．６３０逡逑Ｔ１邋期邐１７邐０．５％±０．３５２７逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2561825