【摘要】：研究背景和目的肝癌是具有高度異質性的復雜物,這為肝癌干細胞的存在提供了理論依據。早期的證據已經說明了肝癌干細胞的擴增有助于肝癌的發(fā)生。大量的研究證實腫瘤干細胞具有很強的腫瘤起始的能力、自我更新的能力、較強的轉移能力、化療抵抗以及促進血管生成的能力。與肝癌干細胞相比,肝前體細胞(LPC Hepatic progenitor cell)主要分布在成人的肝臟組織中,具有有限的自我更新能力和較低的分化潛能。肝前體細胞又叫卵圓細胞,主要是分布在肝臟的赫林氏管上的正常上皮細胞。有文獻報道OV6或者CK19可以作為LPC特有的標志物,LPC具有向肝實質細胞和膽管細胞雙向分化的能力,當發(fā)生組織損傷或者炎癥時被激活,但只有當發(fā)生遷延不愈的炎癥刺激時才會產生代償性的擴增。大量的研究表明LPC的活化擴增可以明顯的促進其惡性轉變,這可能是由LPC轉變成肝癌干細胞的最直接證據。然而在慢性炎癥導致肝癌發(fā)生的過程中,LPC是否轉變成肝癌干細胞的現象及機制并不明確,仍需進一步探究。目前肝癌的常規(guī)治療包括肝癌切除術、肝臟移植、射頻消融和經動脈化療栓塞術等。然而這些常規(guī)的治療方式并不能有效的去除肝癌干細胞,因此肝癌的復發(fā)率仍然較高。隨著小分子靶點藥物的研究不斷深入,越來越多的靶點藥物開始應用于腫瘤的治療中去。索拉菲尼作為目前唯一被批準用于晚期肝癌治療的小分子化合物,已經廣泛用于晚期肝癌患者的臨床治療。索拉菲尼在體外激酶抑制實驗結果表明,索拉菲尼可以有效的抑制VEGFR1-3、PDGFRβ、C-kit、B-Raf、Raf-1和Flt3等靶點分子。近期有文獻報道索拉菲尼可以通過抑制STAT3的磷酸化從而抑制膽管癌的發(fā)生。為了去探尋慢性炎癥在LPC向肝癌干細胞轉化過程中的作用,我們利用大鼠DEN誘癌模型模擬了在肝癌發(fā)生過程中隨著炎癥的加重,LPC的活化擴增更加明顯,這一現象到肝硬化階段更為突出。有趣的是清除大鼠體內的巨噬細胞后抑制了CK19和OV6雙陽性這種可能LPC來源的肝癌發(fā)生。我們進一步研究發(fā)現TNF-α可以通過調節(jié)UBD和Chk2的表達,從而引起了染色體的不穩(wěn)定性,這可能是肝前體細胞發(fā)生惡性轉變的原因。臨床病理指標及預后信息分析證明CK19和OV6雙陽性的肝癌患者預后更差,并且對索拉菲尼治療更為敏感。因此我們的結果不僅闡明了慢性炎癥導致LPC向肝癌干細胞惡性轉變的分子機制,同時還提出了一種全新的分子分型,為索拉菲尼的臨床應用提供了指導。研究方法:1.利用免疫組織熒光共染的方法檢測人的肝臟組織(正常肝、纖維化/肝硬化、肝癌癌旁)中LPC標志物CK19和OV6的表達情況,觀察在肝癌發(fā)生各個階段中LPC擴增情況。2.給SOX9-Cre ERT2 DTR-e GFP示蹤小鼠腹腔注射DEN和CCl4試劑,建立DEN+CCl4肝癌發(fā)生模型,對肝癌組織利用HE和免疫組化染色檢測a-SMA和GFP的表達情況,觀察該小鼠模型在肝癌階段中LPC擴增情況。3.給大鼠注射DEN試劑,建立大鼠肝癌發(fā)生模型,通過免疫組化的方法對大鼠肝癌發(fā)生各個階段的肝臟組織(正常肝、纖維化/肝硬化、肝癌癌旁)中CK19和OV6的表達情況進行檢測,觀察在大鼠肝癌發(fā)生各個階段LPC擴增情況。4.對分選出來的OV6陽性的LPC進行RT-PCR檢測成熟的肝細胞標志物(Ttr、Alb)和膽系標志物(CD133、CK19、SOX-9、CD90)的m RNA的表達情況,觀察OV6陽性的LPC是否為前體源性。5.對原代LPC種植在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤組織分別進行HE染色、免疫組化檢測AFP的表達和免疫熒光共染檢測CK19(紅色熒光)和OV6(綠色熒光)的表達情況,鑒別荷瘤組織是否為LPC源性的肝癌組織。6.對大鼠肝硬化階段的組織進行HE染色分析和免疫組化方法檢測CD68、TNF-α、IL-6的表達情況,觀察大鼠誘癌肝硬化階段組織的炎癥浸潤和炎性因子的表達。7.通過尾靜脈注射Gd Cl3的方法建立大鼠巨噬細胞清除模型,利用免疫組化方法檢測肝癌組織中CK19和OV6的表達情況,統(tǒng)計CK19和OV6雙陽性的肝癌比例。8.對大鼠和小鼠的原代肝細胞以及肝前體細胞系(WB、LEPC)進行IL-6Rα、IL-6Rb和TNFR免疫蛋白印跡檢測,觀察IL-6Rα、IL-6Rb和TNFR的表達情況。9.將TNF-α長期作用的WB細胞種植于NOD/SCID小鼠皮下,對其成瘤的組織進行HE染色、免疫組化檢測AFP的表達和免疫熒光共染檢測CK19(紅色熒光)和OV6(綠色熒光)的表達情況,觀察荷瘤組織是否為LPC來源的肝癌。10.利用體內有限稀釋的方法,觀察TNF-α長期作用的WB-F344和LEPC細胞系在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤能力。11.利用流式細胞檢測技術分析TNF-α長期作用的WB-F344和LEPC細胞系中CD90和Ep CAM的表達情況,觀察炎癥因子TNF-α長期作用是否促進LPC向肝癌干細胞轉變。12.對TNF-α長期作用的WB-F344和LEPC細胞進行染色體核型分析檢測,分析WB-F344和LEPC細胞的染色體數目,研究TNF-α長期作用的WB-F344和LEPC細胞是否發(fā)生了染色體不穩(wěn)定性。13.利用蛋白免疫印跡、RT-PCR和細胞免疫熒光等技術檢測TNF-α長期作用的WB-F344和LEPC細胞中DNA損傷、細胞有絲分裂檢查點和中心體的標志物,探究染色體不穩(wěn)定性的機制。14.利用免疫組化分析技術,分別檢測了163例肝癌組織中CK19和OV6的表達情況,統(tǒng)計分析CK19和OV6雙陽性組和對照組的臨床病理信息和患者預后資料,研究CK19和OV6雙陽性患者的病理特征和預后關系。15.利用蛋白免疫印跡的方法檢測TNF-α長期作用的WB和LEPC細胞中加入索拉菲尼后STAT3磷酸化水平,探究索拉菲尼抑制TNF-α長期作用的WB和LEPC細胞生長的機制。16.利用細胞成球實驗和流式細胞檢測技術,檢測TNF-α長期作用的WB和LEPC細胞加入索拉菲尼后的成球數目和細胞凋亡比例,探究索拉菲尼對TNF-α長期作用的WB和LEPC細胞功能的影響。17.利用免疫組化分析技術檢測203例肝癌術后服用索拉菲尼和77例術后未服用索拉菲尼的肝癌患者組織中CK19和OV6的表達情況,統(tǒng)計分析各組肝癌患者預后資料,評估索拉菲尼對CK19和OV6雙陽性肝癌患者的治療效果。研究結果:1.在肝癌患者疾病進展過程中,隨著病情的進展LPC不斷擴增,其中肝硬化階段LPC明顯擴增。2.利用大鼠DEN誘癌模型模擬人的肝癌發(fā)生,研究發(fā)現大鼠誘癌過程中LPC不斷擴增,其中肝硬化階段LPC明顯擴增。3.為了研究肝巨噬細胞對LPC擴增的影響,我們發(fā)現DEN大鼠誘癌過程中,在肝硬化階段巨噬細胞明顯浸潤,炎癥因子分泌增多,說明巨噬細胞可能促進了LPC的擴增。4.我們通過實驗發(fā)現,在DEN誘癌模型的肝硬化階段,由慢性炎癥刺激擴增的LPC在NOD/SCID的小鼠皮下可以成瘤,說明這個階段的LPC可能已經向肝癌干細胞發(fā)生轉化。5.為了進一步驗證巨噬細胞在LPC向肝癌干細胞轉化過程中的作用,我們建立了Gd Cl3清除肝臟巨噬細胞的大鼠模型,我們發(fā)現巨噬細胞清除組,CK19和OV6雙陽性的肝癌發(fā)生受到抑制。6.我們利用肝巨噬細胞分泌主要炎癥因子TNF-α和IL-6分別刺激大鼠肝前體細胞系WB-F344,20w后將其種在NOD/SCID小鼠皮下,發(fā)現TNF-α長期刺激的LPC在皮下可以成瘤,這說明了TNF-α可能促進LPC發(fā)生轉化。7.為了探究TNF-α長期作用的LPC是否具有肝癌干細胞的特征,我們檢測了肝癌干細胞標志物CD90和Ep CAM,發(fā)現長期刺激組的標志物表達都明顯升高,說明TNF-α長期作用的LPC獲得了肝癌干細胞特征。8.為了探究LPC向肝癌干細胞轉化的具體機制,我們對TNF-α長期作用的WB和LEPC細胞系做了染色體核型分析,發(fā)現TNF-α刺激可以導致LPC染色體數目發(fā)生改變。9.前期的結果部分說明了CK19和OV6雙陽性的肝癌可能是LPC來源的,我們的臨床分析發(fā)現這部分的肝癌患者預后更差。10.我們發(fā)現索拉菲尼可以通過抑制STAT3磷酸化抑制LPC來源的肝癌干細胞生長。11.臨床分析研究發(fā)現CK19和OV6雙陽性的肝癌患者可能對索拉菲尼治療更敏感。結論:本課題主要是研究肝臟在慢性炎癥環(huán)境下,LPC可以明顯擴增,擴增的LPC在炎癥因子的刺激下可以部分轉變成為肝癌干細胞。我們通過研究發(fā)現,CK19和OV6雙陽性的肝癌可以部分認為是LPC惡性轉化而來的腫瘤,臨床分析結果提示CK19和OV6雙陽性的肝癌患者預后更差,并且對索拉菲尼治療更為敏感。上述的研究結果可能對索拉菲尼在肝癌的臨床治療中有指導價值。
【圖文】：

1. 人體肝癌發(fā)生過程中肝硬化階段 LPC 擴增明顯。（A）肝癌發(fā)生不同階段的肝組織 CK19（紅）和 OV6（綠）免疫熒光共染代表性圖片，細胞核用 DAPI 染色cale bar =100 μm.二、大鼠 DEN 誘癌過程中肝硬化階段 LPC 擴增明顯為了模擬人體肝癌發(fā)生過程中 LPC 不斷擴增的現象，我們首先利用OX9-CreERT2 DTR-eGFP（LPC 譜系示蹤）小鼠建立了 DEN 和 CCl4 的小鼠誘癌型。當我們對肝癌階段的肝臟組織進行 LPC 標志物（SOX9/GFP）組化檢測的時，我們遺憾的發(fā)現該模型小鼠癌旁組織沒有發(fā)生典型的肝硬化，，同時在形成的肝組織中也沒能檢測到明顯的 LPC 擴增現象（圖 2A）。這說明 DEN 和 CCl4 的小誘癌過程中并不能產生肝硬化階段，所以并不能夠很好的模擬人體肝癌發(fā)生過程的 LPC 擴增現象。接下來我們建立了大鼠 DEN 誘導肝癌發(fā)生模型。我們對 8 周160-180g)齡的 Wistar 大鼠腹腔注射 DEN，每周一次每次 70mg/kg，持續(xù)注射 10 周圖 2B 所示，我們對處于不同階段（正常對照組 0w、肝炎—纖維化 0w-11w、肝

圖 2. 大鼠 DEN 誘癌過程中肝硬化階段 LPC 擴增明顯。（A）DEN 和 CCl4 同時處理 16 周 SOX9-CreERT2 DTR-eGFP 小鼠的肝臟組織進行 H&E 和 -SMA、GFP 免疫組化染色以及 GFP 免疫組織熒光染色分析代表性圖片，GFP 代表 SOX9 陽性的細胞。Scale bar = 100 μm. （B）對 DEN 大鼠誘癌模型中不同階段的肝臟組織，進行CD68 和 SMA 免疫組化染色代表圖片。Scale bar = 100 μm.（C）對 DEN 大鼠誘癌模型中不同階段的肝臟組織，進行 CK19 和 OV6 免疫組化染色代表圖片。Scale bar= 100 μm.
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 Sonia Pascual;Iván Herrera;Javier Irurzun;;New advances in hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Hepatology;2016年09期

本文編號：2560766