發(fā)布時間：2019-11-11 10:50

【摘要】：原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌,Hepatocellular carcinoma,HCC)是常見惡性腫瘤,近年來在世界范圍內發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢,給社會經濟帶來沉重負擔。手術切除是其主要治療手段,但是手術后腫瘤的高復發(fā)率嚴重影響了治療效果,研究預測腫瘤手術切除后復發(fā),是提高肝癌臨床療效,改善患者預后及生存質量亟待解決的重大科學問題。隨著二代測序技術和生物信息分析技術的進展,發(fā)現(xiàn)越來越多的長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,是目前研究的最前沿領域,是新的腫瘤標志物和藥物靶標的重要來源。因為長鏈非編碼RNA對腫瘤的調控處于基因的上游階段,受干擾較少,研究其對肝癌的預后影響及機制,能夠為肝癌臨床診斷與治療提供了新的研究策略。第一部分:肝細胞肝癌組織和癌旁組織中差異表達的長鏈非編碼RNA的篩選與功能學驗證研究目的:篩選出在肝癌組織和癌旁組織中差異表達的長鏈非編碼RNA并在組織學和細胞系中驗證其差異表達能力,選取進一步研究的目標RNA。研究方法:利用二代測序技術和生物信息學分析方法篩選肝切除術后肝癌組織和癌旁組織中差異表達的長鏈非編碼RNA,并進一步在正常肝細胞系、肝癌細胞系中驗證其表達能力。研究結果:利用構建的肝癌基因芯片同時檢測肝癌組織和癌旁組織中長鏈非編碼RNA和信使RNA的表達量,篩選出差異性表達的LncRNA632條和mRNA391條,其中7條 LncRNA (p2609/p33560/ p3816/p40127-v4/p22534/p8751/p42540-v4)在肝癌病人中與mRNA表現(xiàn)出一致表達,15條LncRNA被檢測出呈現(xiàn)出明顯差異表達。通過細胞和組織學驗證,結果顯示IncRNA-C2、LncRNA-P7和LncRNA-P12呈現(xiàn)出明顯差異性表達,有統(tǒng)計學意義,遂選定差異表達最明顯的LncRNA-P7,并命名為LINC RP1130-1。核質分離實驗結果顯示:LINC RP1130-1絕大部分存在于細胞質中,則表明LINC RP1130-1很可能通過與某個特定通路蛋白結合發(fā)揮其調控功能。在了解了 LINC RP1130-1的作用部位后,我們對其在HCC復發(fā)與轉移的作用做了進一步的機制研究。第二部分:LINC RP1130-1通過STAT1-MAPK通道影響肝癌的復發(fā)與轉移研究目的:探索L INC RP1130-1在肝癌復發(fā)轉移中的可能作用機制。研究方法:通過轉染質粒,過表達基因和沉默基因表達技術、蛋白免疫印跡技術、細胞活力測定、細胞增殖與凋亡能力等方法,分別在基因水平,蛋白水平進行實驗,尋找LINC RP1130-1的基因靶點和可能的蛋白位點。研究結果:研究表明LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)可以抑制肝癌腫瘤細胞的增殖,促進肝癌細胞的凋亡過程;研究還發(fā)現(xiàn)LINC RP1130-1可調控STAT1基因的轉錄,并進而影響該基因所關聯(lián)的蛋白質表達水平;其表達量增加可顯著降低STAT1基因的轉錄水平,降低STAT1蛋白和ERK1/2蛋白的表達量。我們認為LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)可能是通過STAT-MAPK信號通路在肝癌復發(fā)轉移過程中起到重要作用。第三部分:長鏈非編碼RNA (LNCRNA-P7/LINCRP1130-1)與臨床信息的關系研究目的:研究LINC RP1130-1與肝癌病人臨床相關信息之間的關聯(lián)關系,探討LINC RP1130-1在臨床診治中的意義和作用。研究方法:分別測量肝癌組織和癌旁組織中的LINC RP1130-1表達量,將其按照表達量高低分為兩組,采用統(tǒng)計學方法分析兩組病人之間其他臨床信息之間差異。研究結果:研究發(fā)現(xiàn)相比較對應的癌旁組織中的表達量,LINC RP1130-1在肝癌組織中的表達量呈現(xiàn)明顯低表達,在肝癌細胞系中的驗證也證實LINC RP1130-1在肝癌細胞中的表達量低于正常肝細胞,而且LINC RP1130-1低表達組無瘤生存時間(disease free survival, DFS)較高表達組顯著延長,兩組之間有統(tǒng)計學差異(P=0. 047)。研究中還發(fā)現(xiàn)LINC RP1130-1的表達與臨床分期、肝硬化,門靜脈癌栓、微血管癌栓、腫瘤數(shù)量等因素密切相關。受試者曲線面積(Areaundercurve,AUC)為0.74,這表明LINC RP1130-1的表達在肝癌診斷中具有很好的特異性和敏感性,能夠很好的用于肝癌的早期診斷。結論:很多研究表明,長鏈非編碼RNA在人體內廣泛存在,參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。我們的研究發(fā)現(xiàn),相比較正常肝細胞,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)在肝癌細胞系表現(xiàn)為顯著的低表達,同樣,相比較于癌旁組織,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)在肝癌組織中也表現(xiàn)為顯著的低表達,具有統(tǒng)計學差異。進一步將LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)與臨床病人資料進行關聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)的表達與臨床分期、肝硬化,門靜脈癌栓、微血管癌栓、腫瘤數(shù)量等因素密切相關。LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)低表達組無瘤生存時間比高表達組顯著延長,兩組之間有統(tǒng)計學差異(P=0.047)。受試者曲線面積(AUC)為 0.74,表明 LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)的表達在肝癌診斷中具有很好的特異性和敏感性,能夠很好的用于肝癌的早期診斷�？偟膩碚f,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程,可以作為一類新型的具有生物學功能的臨床標志物進一步研究,具有非常廣闊的臨床應用前景。
【圖文】：

解放軍醫(yī)學院博士學位論文逡逑實驗結果逡逑一、目標ＬｎｃＲＮＡ的篩選逡逑我們利用基因芯片和生物信息學分析比較得出：肝癌組織與癌旁組織中共有３９１逡逑條ＬｎｃＲＮＡｓ和６３２條ｍＲＮＡｓ有顯著差異表達（差異倍數(shù)＞２，ＦＤＲ值＜０．０５）。結逡逑果顯示：與患者癌旁組織相比較，肝癌組織中有許多ＬｎｃＲＮＡ與ｍＲＮＡ表達量發(fā)生逡逑了差異。預示著癌組織中的表觀遺傳學調控網(wǎng)絡發(fā)生了很大的改變，有助于后期相關逡逑研究者更好的探討ＬｎｃＲＮＡｓ與腫瘤疾病轉移及復發(fā)間的關聯(lián)。逡逑

圖２：差異表達ＬｎｃＲＮＡｓ和ｍＲＮＡ聚類圖。通過基因芯片篩選，可以發(fā)現(xiàn)肝癌與逡逑癌旁組織中有３９１條ＬｎｃＲＮＡｓ邋（左）和６３２條ｍＲＮＡｓ邋（右）有顯著差異表達。（ＦＣ＞２，逡逑ＦＤＲＣＯ．邋０５，綠色區(qū)域越明亮代表下調倍數(shù)越大，紅色區(qū)域越明亮代表上調倍數(shù)越大）逡逑隨后我們對上述ＬｎｃＲＮＡ與ｍＲＮＡ進行了共表達分析，分析顯示有７條ＬｎｃＲＮＡ逡逑與相應ｍＲＮＡ呈現(xiàn)顯著相關性（Ｒ２＞０．９９９），這７條ＬｎｃＲＮＡ在腫瘤中呈現(xiàn)顯著下逡逑調趨勢（圖３．綠色區(qū)域越明亮代表下調倍數(shù)越大，紅色區(qū)域越明亮代表上調倍數(shù)越逡逑大）。預示著這７條ＬｎｃＲＮＡ與其相應共表達的ｍＲＮＡ調控可能已經失調。在腫瘤發(fā)逡逑生發(fā)展過程中起著重要的調控作用，同樣也預示著這７條ＬｎｃＲＮＡ可能是通過影響逡逑這些ｍＲＮＡ的表達從而發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能。同時，，這些ｍＲＮＡ也可能逡逑是這７條ＬｎｃＲＮＡ的靶基因。逡逑
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 Ai-Ru Hsieh;Cathy SJ Fann;Chau-Ting Yeh;Hung-Chun Lin;Shy-Yi Wan;Yi-Cheng Chen;Chia-Lin Hsu;Jennifer Tai;Shi-Ming Lin;Dar-In Tai;;Effects of sex and generation on hepatitis B viral load in families with hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2017年05期

2 呂細林;黃剛;肖曼;劉孟剛;陳sョ

本文編號：2559223