【摘要】：糖代謝異常被認(rèn)為是腫瘤的重要特征之一。上世紀(jì)20年代德國科學(xué)家Otto Warburg首先發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞無論氧氣充足與否,均選擇進(jìn)行產(chǎn)能效率較低的糖酵解途徑,葡萄糖消耗、糖酵解速率以及乳酸生成均較正常細(xì)胞明顯增加,因此稱為“Warburg效應(yīng)”或“有氧糖酵解”。然而,腫瘤細(xì)胞為什么會(huì)發(fā)生糖酵解,其在腫瘤發(fā)生中的作用及機(jī)制等,仍有待于進(jìn)一步研究。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)通路活化是腫瘤中最常見的信號(hào)通路異常。該通路中的抑癌基因如結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體1/2(Tuberous sclerosis complex 1/2,TSC1/2)和人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的失活均可以導(dǎo)致mTOR通路過度活化,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。我們的前期研究表明,mTOR通路活化能夠促進(jìn)Warburg效應(yīng)的發(fā)生。磷酸甘油酸變位酶1(Phosphoglycerate mutase 1,PGAM1)是糖酵解途徑中重要的催化酶之一,在多種腫瘤組織中有高表達(dá),且與糖代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。然而,其在腫瘤中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制并不是很清楚。為探討PGAM1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的可能機(jī)制,以及PGAM1在mTOR通路活化導(dǎo)致的有氧糖酵解和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,本課題研究分為以下三個(gè)部分:第一部分,利用Tsc2和Pten敲除導(dǎo)致mTOR通路活化的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)與野生型MEF進(jìn)行比較,觀察PGAM1的表達(dá)及酶活性變化,并加入mTOR抑制劑雷帕霉素進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。ELT3是Tsc2缺失的細(xì)胞系,其mTOR通路也是活化的,我們通過使用雷帕霉素處理或在ELT3中轉(zhuǎn)入TSC2來抑制mTOR通路,進(jìn)一步觀察PGAM1表達(dá)與酶活性的變化。此外,我們在Tsc2雜合小鼠腎臟腫瘤與野生型小鼠腎臟組織中比較了PGAM1的表達(dá)。同時(shí),我們在人肺癌組織及癌旁組織中觀察PGAM1的表達(dá)。最后,在Tsc2-/-、Pten-/-MEF中穩(wěn)定敲低缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia inducible factor1α,HIF1α)來檢測mTOR是否通過HIF1α來調(diào)節(jié)PGAM1表達(dá),并通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)驗(yàn)證HIF1α對PGAM1的表達(dá)調(diào)控。結(jié)果顯示:PGAM1的蛋白表達(dá)和酶活性在mTOR通路活化的MEF中升高。ELT3細(xì)胞中恢復(fù)TSC2表達(dá)或加入雷帕霉素可以降低PGAM1的表達(dá)和酶活性。PGAM1蛋白的上調(diào)也存在于Tsc2雜合小鼠的腎臟腫瘤組織和人肺癌組織。mTOR通路活化MEF中敲低HIF1α可下調(diào)PGAM1表達(dá),ChIP進(jìn)一步證明了mTOR通路通過HIF1α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活來上調(diào)PGAM1的表達(dá)。第二部分,利用RNA干擾技術(shù)在Tsc2-/-和Pten-/-MEF中敲低PGAM1,觀察細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成,即Warburg效應(yīng)的變化。同時(shí)利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn),觀察PGAM1敲低后對細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力的影響。將Pten-/-PGAM1敲低的MEF與對照MEF接種裸鼠,觀察兩組裸鼠的無瘤生存期和總生存期。結(jié)果顯示:PGAM1蛋白表達(dá)下降可以降低mTOR通路活化導(dǎo)致的Warburg效應(yīng),并且下調(diào)了細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力。接種PGAM1敲低的Pten-/-MEF裸鼠無瘤生存期和總生存期均長于對照組裸鼠,說明PGAM1在腫瘤形成及生長過程中起著重要作用。第三部分,收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)術(shù)后癌組織與癌旁組織28對,檢測其PGAM1信使RNA(message RNA,mRNA)表達(dá)的不同。收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院227例NSCLC和30例結(jié)直腸癌術(shù)后石蠟組織標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測標(biāo)本中PGAM1和磷酸化核糖體蛋白S6(Phospho-ribosomal protein S6,pS6)表達(dá),分析兩者之間的相關(guān)性及其與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示:在NSCLC中,癌組織PGAM1的表達(dá)高于癌旁組織。在NSCLC與結(jié)直腸癌中,PGAM1高表達(dá)的患者總生存期(Overall survival,OS)和無進(jìn)展生存期(Progression free survival,PFS)均較低表達(dá)的患者差,且PGAM1表達(dá)與mTOR通路活化具有顯著相關(guān)性。綜上所述,得出以下結(jié)論:1)mTOR信號(hào)通路活化上調(diào)糖酵解酶PGAM1表達(dá)及其酶活性,HIF1α介導(dǎo)了mTOR通路對PGAM1表達(dá)的調(diào)節(jié)。2)PGAM1的表達(dá)水平影響腫瘤有氧糖酵解,增殖,克隆和成瘤能力。3)NSCLC腫瘤組織PGAM1表達(dá)升高。NSCLC與結(jié)直腸癌中,PGAM1高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān),且PGAM1表達(dá)與mTOR通路活化具有顯著相關(guān)性。
【圖文】：

圖 1.1 pLL3.7 載體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖應(yīng)下雙酶切反應(yīng)體系表 1.2 雙酶切反應(yīng)體系（20μl）試劑 體積 試劑 體積IF1α 序列模板 4μl pLL3.7 質(zhì)粒 4μHpaI 1μl HpaI 1μXhoI 1μl XhoI 1μ10×Buffer 2μl 10×Buffer 2μ去離子水 12μl 去離子水 12μ系分別混勻，低速離心后，置于 37℃水浴中 2 小時(shí);反應(yīng)體系

學(xué)博士學(xué)位論文 一、mTOR 通路對 PGAM1 表達(dá)的調(diào)控M1 蛋白表達(dá)和酶活性在 mTOR 通路活化的 MEF 中上調(diào)的主要工具是基因敲除的 MEF 和野生型 MEF，理論依據(jù)en 的敲除會(huì)導(dǎo)致 mTOR 信號(hào)通路的過度活化，以此為基礎(chǔ)應(yīng)-actin，TSC2/PTEN，S6，pS6，和 PGAM1 的蛋白表達(dá)水平。其TSC2/PTEN 用來檢驗(yàn)基因敲除效果，pS6 作為 mTOR 通并以總 S6 為參照。結(jié)果證明，Tsc2 和 Pten 敲除 MEF 中生型 MEF，，用雷帕霉素處理之后 pS6 表達(dá)水平明顯下降除 MEF 是 mTOR 通路活化的。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與野生型路過度活化 MEF 中 PGAM1 的表達(dá)明顯升高，加入雷達(dá)明顯減少，說明 PGAM1 的表達(dá)受到 mTOR 調(diào)控（圖 1
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2558780