【摘要】：研究背景據(jù)國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示,2015年我國預(yù)計(jì)新增的惡性腫瘤病例達(dá)429.2萬例,其中肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤發(fā)病比例較高。有報(bào)道指出75-90%進(jìn)展期及終末期的癌癥病人必須接受慢性疼痛治療,其中骨癌痛是治療的重要部分。骨癌痛常發(fā)生于原發(fā)性的骨骼惡性腫瘤或繼發(fā)于前列腺癌、肺癌、乳腺癌等最常波及骨骼的高轉(zhuǎn)移性腫瘤。當(dāng)累及骨骼時,起初表現(xiàn)為鈍性疼痛,逐漸進(jìn)展為中至重度的持續(xù)痛并伴有爆發(fā)痛,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著診療技術(shù)的發(fā)展,癌癥患者的生存率顯著增加,因此惡性腫瘤導(dǎo)致的骨骼疼痛成為迫切需要解決的問題之一,然而骨癌痛的發(fā)病機(jī)制目前所知有限,極大地阻礙了對骨癌痛的有效治療。研究發(fā)現(xiàn),慢性疼痛的發(fā)生是以基因背景為基礎(chǔ),與個體所處客觀環(huán)境相互作用的結(jié)果,其中的候選基因包括HLA。脊髓是慢性疼痛發(fā)生中樞敏化的關(guān)鍵部位,研究發(fā)現(xiàn),主要組織相容性復(fù)合體II (Major Histocompatibility Class II, MHC II)高表達(dá)于慢性疼痛動物的脊髓背角,抑制該分子表達(dá)能夠顯著改善神經(jīng)損傷導(dǎo)致的異常疼痛和痛覺超敏。據(jù)此推測MHC II可能是介導(dǎo)慢性疼痛中樞敏化的分子之一,然而該分子在骨癌痛發(fā)生中的作用目前所知甚少。JAK/STAT1信號通路執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活兩個方面的功能,在抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)參與啟動CIITA (MHC Class II Transactivator, CIITA)的轉(zhuǎn)錄,而CIITA又調(diào)控MHC II的表達(dá),因此,JAK/STAT1信號通路是調(diào)控MHC II表達(dá)的重要因素,抑制該通路后有可能緩解骨癌痛癥狀。MEK/ERK信號通路是參與小膠質(zhì)細(xì)胞激活的MAPK成員之一,主要執(zhí)行小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和促炎性介質(zhì)的釋放,研究指出,JAK/STAT1與MEK/ERK信號通路之間存在著相互聯(lián)系,據(jù)此我們提出研究假說：脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞JAK/STAT1信號通路激活,通過調(diào)控CIITA的表達(dá)導(dǎo)致MHC II分子表達(dá)上調(diào)并參與骨癌痛的發(fā)生；此外,MEK/ERK信號通路與JAK/STAT1信號通路之間存在相互聯(lián)系。研究方法與結(jié)果1 MHCⅡ參與骨癌痛發(fā)生方法實(shí)驗(yàn)一：選擇健康成年雌性健康SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和骨癌痛組,建立骨癌痛大鼠模型,分別在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21d測定手術(shù)側(cè)肢體的機(jī)械性縮爪閾值(Mechanical Paw Withdrawal Threshold, MPWT),利用Western blot和免疫熒光染色檢測MHC II及其調(diào)控分子CIITA在脊髓的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)二：建立骨癌痛大鼠動物模型,鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素或者脊髓微注射LV-Ciita-RNAi定向沉默CIITA,觀察下調(diào)MHC II表達(dá)后大鼠疼痛行為的變化,免疫熒光染色觀察慢病毒在脊髓背角的轉(zhuǎn)染效果,RT-PCR驗(yàn)證LV-Ciita-RNAi沉默CIITA情況；選擇LV-Ciita-RNAi及陰性對照慢病毒干擾的骨癌痛大鼠和正常大鼠,鞘內(nèi)注射重組大鼠IFNy誘導(dǎo)MHC Ⅱ表達(dá)上調(diào),并驗(yàn)證LV-Ciita-RNAi沉默CIITA的效果。Western blot檢測干預(yù)后CIITA和MHC Ⅱ在脊髓的表達(dá)變化。結(jié)果骨癌痛組大鼠在模型建立后7、14和21 d表現(xiàn)為典型的異常疼痛,同時CIITA和MHC Ⅱ的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素或脊髓微注射LV-Ciita-RNAi均能夠顯著抑制MHC Ⅱ的表達(dá)上調(diào),并明顯改善骨癌痛癥狀。鞘內(nèi)注射重組大鼠IFNy能誘導(dǎo)MHC Ⅱ在陰性對照病毒注射的骨癌痛大鼠和正常大鼠脊髓的表達(dá)上調(diào),對LV-Ciita-RNAi干擾的骨癌痛大鼠無顯著影響。2 JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路激活并參與骨癌痛發(fā)生方法實(shí)驗(yàn)一：選擇健康成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和骨癌痛組,建立骨癌痛大鼠模型,分別在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21d測定手術(shù)側(cè)肢體的MPWT,利用Western blot和免疫熒光染色檢測pSTAT1和pERK在脊髓的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)二：建立骨癌痛大鼠模型,鞘內(nèi)注射JAK抑制劑AG490、STAT1抑制劑Fludarabine和MEK抑制劑U0126,每日1次；分別在模型建立前和建立后3、7、10和14 d觀察手術(shù)側(cè)肢體的MPWT;于手術(shù)后14d安樂死大鼠取脊髓腰膨大,利用Western blot檢測pSTAT1、pERK、CIITA和MHCⅡ的表達(dá)變化。結(jié)果骨癌痛大鼠脊髓的pSTAT1和pERK的表達(dá)水平顯著上調(diào)。鞘內(nèi)注射Fludarbine和U0126能夠顯著地抑制pSTAT1、pERK、CIITA和MHCⅡ的表達(dá)上調(diào),同時顯著性地改善骨癌痛的MPWT下調(diào),而AG490對上述作用有限。3 JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路激活介導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞MCHⅡ的表達(dá)方法體外培養(yǎng)出生24 h內(nèi)大鼠大腦皮層的原代小膠質(zhì)細(xì)胞,重組大鼠IFNy誘導(dǎo)JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路激活；干預(yù)組在IFNy刺激前30 min分別加入AG490、Fludarabine和U0126,24 h后提取細(xì)胞總蛋白,利用Western blot檢測pSTAT1、 pERK、CIITA和MHCⅡ蛋白表達(dá)水平的變化情況。結(jié)果IFNy能夠顯著地激活JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路,同時導(dǎo)致CIITA和MHC II的表達(dá)顯著上調(diào)；抑制劑Fludarabine或U0126分別顯著抑制JAK/STAT1或MEK/ERK信號通路激活,但均能夠抑制CIITA和MHC II的表達(dá)上調(diào),其中U0126能夠抑制STAT1的磷酸化激活,而Fludarabine對ERK的磷酸化水平無顯著影響；AG490對上述通路激活的抑制作用相對有限。4統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以x±SEM表示；兩個變量之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多個變量的比較采用one-way ANOVA,組間行為學(xué)結(jié)果分析采用two-way ANOVA;統(tǒng)計(jì)結(jié)果的圖片制作采用GraphPad prism 5, p 0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究總結(jié)1主要研究結(jié)果1.1骨癌痛大鼠脊髓MHC II表達(dá)上調(diào),特異地表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞；鞘內(nèi)注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑或脊髓微注射慢病毒定向沉默CIITA基因,能顯著降低MHC II的表達(dá)水平,并顯著改善大鼠的骨癌痛癥狀；1.2骨癌痛大鼠脊髓信號通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活,磷酸化激活性的pSTAT1和pERK表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；鞘內(nèi)注射抑制劑能顯著抑制信號通路,并抑制MHC II的表達(dá)上調(diào),同時顯著緩解骨癌痛大鼠的痛覺異常；1.3重組大鼠IFNy刺激體外培養(yǎng)的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞,能夠激活信號通路JAK/STAT1和MEK/ERK,并誘導(dǎo)MHC II的表達(dá)水平上調(diào)；抑制信號通路激活能夠顯著抑制MHC II的表達(dá)。2研究結(jié)論2.1骨癌痛大鼠的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MHC II并介導(dǎo)骨癌痛發(fā)生；2.2 JAK/STAT1是調(diào)節(jié)MHC II表達(dá)的重要信號通路；2.3小膠質(zhì)細(xì)胞的信號通路MEK/ERK對JAK/STAT1有單向調(diào)控作用。3創(chuàng)新之處3.1首次揭示了MCHⅡ分子在骨癌痛發(fā)生中的作用；3.2首次發(fā)現(xiàn)JAK/STAT1信號通路參與骨癌痛發(fā)生；3.3揭示了骨癌痛病理情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞的信號通路MEK/ERK對JAK/STAT1的單向調(diào)控作用。4展望4.1本研究發(fā)現(xiàn)MHC II表達(dá)于骨癌痛大鼠脊髓的小膠質(zhì)細(xì)胞,可能是骨癌痛治療的新靶點(diǎn),然而MHC II分子是否參與抗原遞呈功能并誘導(dǎo)外周的CD4+T細(xì)胞遷移進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),二者相互作用導(dǎo)致脊髓的神經(jīng)炎癥反應(yīng),進(jìn)而參與骨癌痛病理過程目前仍然不明確,需要在將來的工作中進(jìn)一步研究；4.2該研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞的信號通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活,誘導(dǎo)MHC Ⅱ表達(dá)并參與骨癌痛發(fā)生,揭示了骨癌痛形成的信號通路調(diào)控機(jī)制,然而上述信號通路介導(dǎo)的生物學(xué)功能復(fù)雜,二者之間存在密切聯(lián)系,在揭示其參與骨癌痛發(fā)生的機(jī)制方面仍然需要更深入的研究；此外,誘導(dǎo)信號通路激活的上游信號分子亦需要進(jìn)一步闡明。
【圖文】：

中科技大學(xué)博去學(xué)位論文逡逑結(jié)果逡逑腔內(nèi)種植Ｗａｌｋｅｒ邋２５６乳腺癌細(xì)胞成功建立骨癌痛大鼠動物模的測定結(jié)果顯示，ＢＣＰ組大鼠在手術(shù)后７邋ｄ手術(shù)側(cè)的ＭＰＷＴ基礎(chǔ)值１０．７８邋±化４２邋ｇ，且呈現(xiàn)時間依賴性地持續(xù)降低，２１邋ｄ．５６邋ｇ，發(fā)展為典型的痛覺過敏；Ｓｈａｍ組大鼠各時間點(diǎn)的ＭＰＷＴ變化（國１）。該結(jié)果說明大鼠腔骨骨髓腔接種Ｗａｌｋｅｒ邋２％乳低，發(fā)展為痛覺過敏，符合骨癌痛的典型表現(xiàn)。逡逑

性破壞進(jìn)一步加重，腔骨近端骨哶分離，有明顯的骨折線；２１邋ｄ時由于皮質(zhì)骨的破壞，逡逑Ｗａｌｋｅｒ邋２％s侔┫赴ド⒅燎還槍撬棖煌�，发生转移须Eぃ邐杉那還喬叭礤義蟷D織影像面積顯著增加，同時溶骨性破壞及病理性骨折進(jìn)一步發(fā)展（圖２）。這些結(jié)逡逑果說明腔骨骨髓腔內(nèi)種植Ｗａｌｋｅｒ邋２５６乳腺癌細(xì)胞導(dǎo)致時間依賴性的溶骨性骨骼破壞，逡逑誘發(fā)病理性骨折，符合骨癌痛患者的病理發(fā)展過程。逡逑ｍ拍逡逑圖２．大鼠右側(cè)腔骨Ｘ線平片檢查結(jié)果逡逑Ｘ線平片顯示ＢＣＰ組大鼠手術(shù)側(cè)腔骨近端的骨骼呈進(jìn)行性破壞，骨密度降低伴有病理性逡逑骨折（紅色箭頭所示部位），２１邋ｄ時腫瘤突破骨髓腔轉(zhuǎn)移至周圍軟組織；Ｎａｉｖｅ組和Ｓｈａｍ組逡逑２１邋ｄ大鼠骨骼無顯著性改變。Ｘ線曝光參數(shù)：管電壓４５？５０邋ｋＶｐ，，曝光時間５？１０邋ｍＡｓ。標(biāo)逡逑尺＝１邋ｃｍ。逡逑大鼠安樂死后右側(cè)腔骨取材，剝除骨骼表面軟組織結(jié)構(gòu)，肉眼觀察腔骨近端的大逡逑體標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)ＢＣＰ組大鼠１４邋ｄ和２１邋ｄ時骨骼的外側(cè)皮質(zhì)表面凹凸不平，呈現(xiàn)蟲蝕樣逡逑外觀
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738

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本文編號：2558506